1、I C S6 7.0 5 0C C SC 5 3中华人民共和国出入境检验检疫行业标准S N/T5 4 3 9.32 0 2 2 出口食品中食源性致病菌快速检测方法 P C R-试纸条法 第3部分:副溶血性弧菌R a p i d d e t e c t i o n o f f o o d b o r n e p a t h o g e n s f r o m e x p o r t e d f o o d b y P C R-L a t e r a l f l o w d i p s t i c k m e t h o dP a r t 3:V i b r i o P a r a h e m o
2、 l y t i c u s2 0 2 2-0 3-1 4发布2 0 2 2-1 0-0 1实施中华人民共和国海关总署发 布以正式出版文本为准以正式出版文本为准前 言本文件按照G B/T 1.12 0 2 0 标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则 的规定起草。本文件是S N/T 5 4 3 9的第3部分。S N/T 5 4 3 9已经发布了以下部分:第1部分:沙门氏菌;第2部分:金黄色葡萄球菌;第3部分:副溶血性弧菌;第4部分:克罗诺杆菌;第5部分:产志贺毒素大肠埃希氏菌及大肠埃希氏菌O 1 5 7;第6部分:空肠弯曲菌;第7部分:单核细胞增生李斯特氏菌。请注意本文件的某些内容
3、可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。本文件起草单位:中华人民共和国南京海关、南京农业大学、中华人民共和国上海海关、中华人民共和国福州海关、合肥工业大学、苏州蝌蚪生物技术有限公司、广东省科学院微生物研究所、广东环凯生物科技有限公司、中华人民共和国合肥海关、杭州傲敏生物科技有限公司。本文件主要起草人:薛峰、曾德新、郭菁、蒋原、陈伟、雷涛、庞锐、曲晓莹、戴建君、苏静、陆寿祥、申进玲、汤芳、余晓峰、凌南。S N/T5 4 3 9.32 0 2 2以正式出版文本为准以正式出版文本为准出口食品中食源性致病菌快速检测方法 P C R-试纸条法 第3部
4、分:副溶血性弧菌1 范围本文件规定了出口食品中食源性致病菌-副溶血性弧菌快速检测的P C R-试纸条方法。本文件适用于出口食品中副溶血性弧菌的定性检测。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。G B 4 7 8 9.72 0 1 3 食品安全国家标准 食品微生物学检验 副溶血性弧菌检验 G B/T 6 6 8 2 分析实验室用水规格和试验方法 G B/T 2 7 4 0 32 0 0 8 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测3 术
5、语和定义 下列术语和定义适用于本文件。副溶血性弧菌 V i b r i o P a r a h a e m o l y t i c u s其是一种嗜盐性的革兰氏阴性菌,棒状、弧状、卵圆状无芽孢菌,属于弧菌属,是一种常见的病原菌。4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。D NA:脱氧核糖核酸(d e o x y r i b o n u l e i c a c i d)d NT P:脱氧核苷酸三磷酸(d e o x y r i b o n u l e o s i d e t r i p h o s p h a t e)E D T A:乙二胺四乙酸(e t h y l e n e d i a m i n
6、 e t e t r a a c e t i c a c i d)F I T C:异硫氰酸盐(f l u o r e s c e i n 5-i s o t h i o c y a n a t e)T r i s:三羟甲基氨基甲烷t r i s(h y d r o x y m e t h y l)a m i n o m e t h a n e5 方法原理 对样品中副溶血性弧菌进行增菌培养后提取D NA,采用上游和下游引物分别经地高辛和异硫氰酸盐标记的副溶血性弧菌的特异性检测引物进行P C R扩增。检测用试纸条上含有金标记的抗异硫氰酸盐的抗体,可与P C R产物上的异硫氰酸盐标记分子结合,在检测
7、线位置上有抗地高辛抗体,可与P C R产物上的地高辛标记分子结合,从而显色。如模板未扩增,则无P C R产物与地高辛抗体及F I T C抗体结合,从而不能在检测线(T线)位置显示颜色。1S N/T5 4 3 9.32 0 2 2以正式出版文本为准6 试剂和材料 除另有规定外,试剂为分析纯或生化试剂,实验用水符合G B/T 6 6 8 2的要求。6.1 引物 副溶血性弧菌扩增引物详见表1,靶基因序列参见附录A。表1 试验用引物致病菌种类引物序列(5 3)5 端标记物靶基因片段长度副溶血性弧菌F:5-G T C T T C T G A C G C AA T C G T T G-3地高辛R:5-A
8、TA C GA G T G G T T G C T G T C A T G-3异硫氰酸盐t o x R3 6 7 b p6.2 试剂6.2.1 D NA提取液:2 0 mm o L/L T r i s-HC l,2 mm o l/L E D T A,1.2%T r i t o n X-1 0 0(p H 8.0)。6.2.2 2P C R预混液。6.2.3 P C R引物。6.2.4 试纸条:通过采购的原料试剂自行组装(参见附录B),或采用等效的商品化试纸条。6.2.5 展开液:1 0 mm o l/L T r i s、1%B S A、1%(体积分数)T w e e n 2 0以及浓度为0.0
9、 5 m o l/L的N a OH;或采用等效的商品化产品。7 仪器设备7.1 离心机:离心力1 2 0 0 0 g。7.2 微量移液器:1 0 0 L1 0 0 0 L,2 0 L2 0 0 L,0.5 L1 0 L。7.3 P C R仪。7.4 恒温水浴锅:1 0 0 1。7.5 天平:感量0.0 1 g。7.6 p H计。7.7 核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。8 检验步骤8.1 样品制备和增菌 按照G B 4 7 8 9.72 0 1 3的方法进行样品制备和增菌。8.2 样品D N A提取8.2.1 增菌液模板D N A的制备 对于8.1获得的增菌液,采用如下方法制备模板D NA:a)
10、吸取1 m L菌液加入1.5 m L离心管中,1 2 0 0 0 g离心3 m i n,弃上清;b)加入1 m L 0.8 5%无菌生理盐水,完全溶解沉淀,1 2 0 0 0 g离心3 m i n,弃上清;2S N/T5 4 3 9.32 0 2 2以正式出版文本为准c)加入1 0 0 L D NA提取液混匀后沸水浴1 0 m i n,置冰上冷却;d)1 2 0 0 0 g离心2 m i n,上清液即为模板D NA。也可采用等效的商品化核酸提取试剂盒并按其说明提取核酸。8.2.2 可疑菌落模板D N A的制备 对于8.1分离到的可疑菌落,可直接挑取可疑菌落再按照8.2.1 c)步骤制备模板D
11、NA以待检测。也可采用等效的商品化核酸提取试剂盒并按其说明提取核酸。8.3 D N A浓度和纯度的测定 取5 L D NA溶液加双蒸水稀释至1 m L,使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计分别检测2 6 0 n m和2 8 0 n m处的吸光值A2 6 0和A2 8 0。D NA的浓度按公式(1)计算:c=AN5 0/1 0 0 0(1)式中:c D NA浓度,单位为纳克每微升(n g/L);A 2 6 0 n m处的吸光值;N 核酸稀释倍数。当A2 6 0/A2 8 0比值在1.71.9之间时,适宜于P C R扩增。8.4 P C R 扩增8.4.1 P C R反应体系见表2。表2 P C R
12、反应体系组分 总体积(3 0 L)2 x P C R预混液 1 5 L上游引物(1 0 m o l/L)1 L下游引物(1 0 m o l/L)1 LD NA模板a 1 0 L无菌水 3 L a D NA模板的浓度限定在1 0 p g/L 1 0 n g/L之间。8.4.2 反应条件 9 4 预变性5 m i n;9 4 变性3 0 s,5 8 退火3 0 s,7 2 延伸1 m i n,3 5个循环后进入7 2,7 m i n;4 保存。检测过程中分别设阳性对照、阴性对照和空白对照。用副溶血性弧菌D NA模板作阳性对照,用非副溶血性弧菌D NA模板作阴性对照,用等体积的无菌水代替模板D NA
13、作空白对照。8.4.3 试纸条检测 取6 L P C R产物,加入5 4 L上样稀释液,混匀后垂直缓慢滴加于试条样品垫中,3 m i n观察结果。3S N/T5 4 3 9.32 0 2 2以正式出版文本为准9 质量控制以下条件有一条不满足时,实验视为无效:a)空白对照:质控线变红,检测线未变红;b)阴性对照:质控线变红,检测线未变红;c)阳性对照:质控线变红,检测线变红。1 0 结果判断与表述1 0.1 结果判定试纸条质控线变红色,且检测线变红色,P C R扩增产物为可疑阳性。可疑阳性产物经测序进行确证。试纸条质控线变红色,检测线不变色,P C R扩增产物为阴性。1 0.2 表述P C R产
14、物试纸条检测为可疑阳性,同时测序结果正确者,继续按照传统方法进行分离,若确分离到该菌,判为含副溶血性弧菌,表述为检出副溶血性弧菌;P C R产物试纸条检测为阴性,判为不含有副溶血性弧菌,表述为未检出副溶血性弧菌。1 1 检测过程中防止交叉污染的措施 按照G B/T 2 7 4 0 32 0 0 8中附录D的规定执行。1 2 废弃物处理 检测过程中的废弃物,收集后在焚烧炉中焚烧处理。1 3 检出限本文件所规定方法的最低检出限(L O D)为1 02C F U/m L。4S N/T5 4 3 9.32 0 2 2以正式出版文本为准附 录 A(资料性)P C R产物测序结果 副溶血性弧菌的基因扩增靶
15、标参考序列(g e n n b a n k号:K F 9 9 3 3 5 6.1)如下所示。G T C T T C T GA C G C AAT C G T T GAA C C AGAAG C G C C AG T AG T A C C T GAAAAAG C A C C T G T G G C TT C T G C T G T GAA C C C T T G GAT T C C A C G C G T T AT T T T AT T T T T G G C A C T AT T A C T A C C GAT T TG C G T A C T G C T G T T T A C AAA C
16、C C AG C G GAAT C T C AG T T C C G T C AGAT T G G T GAG T AT C AGAAC G T A C C AG T GAT GA C A C C T G T AAAT C A C C C G C AAAT C AA C AA C T G G T T G C C T T C T AT T GAGC AG T G C AT T GAA C G C T A C G T T AAA C A C C AT G C AGAAGA C T C G T T A C C AG T G GAAG T AAT TG C C A C T G G C G G A C A A A A T A A C C A G C T G A T T T T G A A C T A C A T T C A T G A C A G C A A C C A C T C G T A T5S N/T5 4 3 9.32 0 2 2以正式出版文本为准附 录 B(资料性)含有金标记的抗F I T C的单克隆抗体和固定有地高辛抗体的通用核酸检测试纸条B.1 组成成分B.1.1 地高辛抗体。B