1、基于 Cytb 基因的穿山甲科物种鉴定研究王 辰1,杨娅富1,李 立2,逯金瑶2,李嘉昊1,李 波1,3(1.东北林业大学野生动物与自然保护地学院,黑龙江哈尔滨 150040;2.湖南省生物多样性保护中心,湖南长沙 410000;3.国家林业和草原局野生动植物检测中心,黑龙江哈尔滨 150040)摘要 为鉴别混有非穿山甲物种疑似检材的来源物种,基于细胞色素 b 基因设计了穿山甲科特异的新引物 DCW-F1/DCW-R1。试验表明:其特异性良好、灵敏度较高、适用检材类型较广。采用 BLAST 比对法、遗传距离法和系统发育法分析了 4 组不同长度 Cytb 序列,研究序列长度对穿山甲物种鉴定的影响
2、。结果表明,多数样本与相应穿山甲物种同源序列相似度均高于 98%,建议将该值作为 BLAST比对法的判别标准;除马来穿山甲(211 bp)和树穿山甲(421 和 211 bp)外,剩余 5 个穿山甲物种种间最小遗传距离均大于种内最大遗传距离,序列长度的变化和样本量的不平衡会导致该比值不稳定;除马来穿山甲和菲律宾穿山甲,其余物种均为单系,序列长度变短使得系统发育树拓扑结构和分支置信度发生相应变化。关键词 物种鉴定;穿山甲;细胞色素 b 基因(Cytb);序列分析中图分类号 S863 文献标识码 A 文章编号 0517-6611(2023)03-0089-07doi:10.3969/j.issn.
3、0517-6611.2023.03.020 开放科学(资源服务)标识码(OSID):Species Identification for Pangolins Based on Cytochrome b GeneWANG Chen1,YANG Ya-fu1,LI Li2 et al(1.College of Wildlife and Natural Reserve,Northeast Forestry University,Harbin,Hei-longjiang 150040;2.Hunan Biodiversity Conservation Center,Changsha,Hunan 410
4、000)Abstract A pair of new specific primers DCW-F1/DCW-R1 were designed based on Cytochrome b(Cytb)gene to identify suspected speci-mens mixed with non-pangolin species.The results showed that it was good specificity,high sensitivity and could be used for several type sam-ples.Secondly,we used BLAST
5、 comparison,genetic distance and constructing phylogenetic tree to analyze the four groups of Cytb sequences with different lengths,in order to estimate the influence of changing sequence length on pangolin identification.The results indicated that the similarity of homologous sequence between most
6、samples and corresponding pangolin was higher than 98%.This suggested that the value should be used as the criterion to identify pangolin species.The minimum inter-specific genetic distance(inter-d)was greater than the maximum In-tra-specific genetic distance(intra-d)among five pangolins with the ex
7、ception of M.javanica(211bp)and P.tricuspis(421 and 211 bp).The variation of sequence length and the imbalance of sample size could cause unstable ratio.Phylogenetic trees showed that most pangolin spe-cies except M.javanica and M.culionensis were monophyletic,and their topological structure and con
8、fidence for some nodes changed with the sequence being shorter.Key words Species identification;Pangolin;Cytochrome b;Sequence analysis基金项目 珍稀濒危物种调查监管与行业规范项目(2020070209-4);湖南省林业科技创新计划项目(XLK201915)。作者简介 王辰(1997),男,天津人,硕士研究生,研究方向:分子生物学。通信作者,副教授,从事动物遗传育种与繁殖研究。鸣 谢 试验样本的采集得到了国家林业和草原局野生动植物检测中心徐艳春教授、金煜教授、白
9、素英副教授等的大力支持与帮助,在此一并致谢。收稿日期 2022-03-22 穿山甲是哺乳纲(Mammalia)鳞甲目(Pholidota)穿山甲科(Manidae)动物的统称。现存 3 属 8 种:穿山甲属(Manis)的中华穿山甲(M.pentadactyla)、印度穿山甲(M.crassicauda-ta)、马来穿山甲(M.javanica)和菲律宾穿山甲(M.culionen-sis);地穿山甲属(Smutsia)的南非穿山甲(S.temminckii)和大穿山甲(S.gigantea);长尾穿山甲属(Phataginus)的树穿山甲(P.tricuspis)和长尾穿山甲(P.tetra
10、dactyla),分布于亚洲和非洲的热带和亚热带地区1-6。穿山甲因有食用和药用价值而遭到人类的乱捕滥猎,加之生境被破坏及外来物种入侵等因素,其野生种群数量急剧下降,甚至面临灭绝7-8。2016 年 10 月,CIETS 缔约国大会通过“所有 8 种穿山甲物种由附录 II 提升至附录 I”的提案9-10。由此,为打击穿山甲的非法贸易需要选择合适的分子标记、构建标准的物种鉴定方法。线粒体基因组作为“扩展条形码”11,常用于物种鉴定和系统发育关系评估12-13。该技术成本较为昂贵,不适合在穿山甲非法贸易频发的东南亚和非洲国家推广使用。线粒体细胞色素 b(Cytochrome b,Cytb)基因进化
11、速率适中、含有丰富的遗传信息、结构清晰,被广泛地应用于物种鉴定14。目前,基于 Cytb 基因的穿山甲物种鉴定多是利用脊椎动物或哺乳动物通用引物,所扩增的序列长度长短不一15-18。研究表明,利用穿山甲科特异引物可以有效排除非目标物种的干扰15,Cytb 基因序列长度变化可能影响鉴定结果的判读19。由此,笔者依据 Cytb 基因设计了穿山甲科物种鉴定的特异引物,并评估 4 种长度的 Cytb 基因序列对穿山甲物种鉴定的影响。1 材料与方法1.1 材料 收集 191 份穿山甲样品。其中,174 份为已知马来穿山甲样本,包括 128 份肌肉样,18 份皮肤样,12 份粪便样,7 份毛发样,9 份鳞
12、片样,剩余 17 份样本为未知穿山甲样本,其中包括 1 份疑似穿山甲鳞片粉末(表 1)。利用智人(Homo sapiens,n=3)、貉(Nyctereutes procyonoides,n=3)、朱顶雀(Acanthis flammea,n=3)、东北兔(Lepus mandshuricus,n=1)、牛(Bos taurus,n=1)、虎(Panthera tigris,n=1)、家猪(Sus scrofa domestica,n=1)的 DNA 作为非穿山甲物种对照样本。上述样本均来自国家林业和草原局野生动植物检测中心样本库。样品采集后于-20 冰箱内保存。同时,从 NCBI 上下载 1
13、35 条序列穿山甲物种(表 1)和部分非穿安徽农业科学,J.Anhui Agric.Sci.2023,51(3):89-95 山甲物种的 Cytb 基因同源序列用于引物设计和序列综合分析。1.2 方法1.2.1 DNA 提取。穿山甲鳞片用 75%乙醇清洗表面,经灭菌去离子水清洗、风干后剪取其表面残留的皮肤组织或毛发,或钻取鳞片粉末。将皮肤、毛发及鳞片粉末分别装入1.5 mL 离心管。将肌肉样剪碎后置于1.5 mL 离心管。使用AxyPrepTM Multisource Genomic DNA Miniprep Kit 试剂盒(爱思进)提取肌肉、毛发、皮肤及鳞片的总 DNA。另外,称取18022
14、0 mg 的粪便使用 QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit 试剂盒(爱思进)提取总 DNA。DNA 提取步骤均参考试剂盒说明书,DNA 原液存放于-20 冰箱。表 1 穿山甲科试验样本及 GenBank 来源序列信息Table 1 Experimental samples and sequence information downloaded from GenBank for pangolin种Species来源SourceGenBank 登录号和样本编号 GenBank ID and sample numberMJ-L(1 140 bp)MJ-M(762 bp)MJ-
15、S(421 bp)MJ-DCW(211 bp)印度穿山甲(M.crassicaudata)11NC036433、NC036433、NC036433、NC036433、MG196304MG196306MG196304MG196306MG196304MG196306MG196304MG196306中华穿山甲(M.pentadactyla)20MT335859MT335859MT335859MT335859KT445978MN365834、KT445978MN365834、KT445978KT44597821JN411577、NC016008JN411577、NC016008JN411577、NC0
16、16008JN411577、NC01600811MG196307MG196307MG196307MG196307EU05762EU057637PA-L-1PA-M-1PA-S-1MP-DCW-1马来穿山甲(M.javanica)MT875194、MN365836、KT445979MT875194、MN365833、MN365835、MN365836、KT445979MT875194、MN365833、MN365835、MN365836、KT445979MT875194、MN365836、KT44597913KP306515、NC026781KP306515、NC026781KP306515、NC026781KP306515、NC02678111MG196302、MG196309MG196302、MG196309MG196302、MG196309MG196302、MG19630922MG825495-MG825551MG825495-MG825551MJ-L-1 14、16 18、2029、3135、3748、51 73、75 82、84、90、92 101、103 104、110 11