1、西北大学学报（自然科学版）年 月，第 卷第 期，（）收稿日期：基金项目：国家自然科学基金（）；陕西省重点研发计划项目（）；陕西省教育厅重点实验室项目（）；陕西省重点科技创新团队（）；陕西省教育厅服务地方专项（）第一作者：周坤，男，陕西延安人，从事中药药理学研究。通信作者：赵晔，女，陕西西安人，教授，硕士生导师，从事天然药物化学及成分分析和药物代谢等研究，。中药学基于 信号通路调节糖脂代谢的山楂果叶配伍机制周 坤，王静静，李璐遥，王 鑫，申 雪，寇瑶瑶，马百平，王 梅，郑晓晖，赵 晔（西北大学 国家中医药管理局中药化学（三级）科研实验室，陕西 西安；军事医学科学院 放射与辐射医学研究所，北京；莱
2、顿大学 欧洲中医药和天然产物研究中心 生物学院，荷兰 莱顿）摘要 糖脂代谢病是由遗传、环境和精神状况引起的一种复杂性疾病，其特点是糖、脂代谢紊乱，中医学称之为“消渴症”，随着生活水平和社会压力的提高该疾病呈现多龄化趋势。中药的多组分协同增效使其在长期治疗消渴症方面具有明显优势。山楂果、叶富含有机酸和黄酮类成分，在降糖降脂方面具有显著效果。测定了山楂果、叶提取物中主要成分的含量，建立了 大鼠模型，研究了山楂果叶提取物干预 信号通路进而调节糖脂代谢的作用和机制，结合网络药理学方法分析山楂果、叶治疗 的有效成分、作用靶点和作用机制。结果表明，山楂果、叶配伍给药能更显著降低 大鼠空腹血糖血脂水平，提高
3、糖耐量水平，促进胰岛素分泌，降低脂肪堆积，缩小脂肪细胞，同时调节肝肾功能，增加肝脏 及其磷酸化水平，降低、的蛋白表达。网络药理学共筛选到 个山楂果、叶的有效成分，与疾病交集靶点共 个，参与调控 信号通路、信号通路、胰岛素抵抗等与糖脂代谢相关的多个信号通路。研究表明，山楂的果、叶配伍能够通过干预 通路，协同调节糖脂代谢，并且对于 信号通路、信号通路、胰岛素抵抗等也有调节作用，具有良好的临床应用前景。关键词 山楂果；山楂叶；网络药理学；糖脂代谢中图分类号：，（，（），；，；，），；糖脂代谢紊乱的主要特征是糖代谢紊乱与脂代谢紊乱，与 型糖尿病（）、高血脂、高血压、动脉粥样硬化等心脑血管疾病密切相关，
4、对人类的健康威胁日益严重。中药在治疗糖尿病和高脂血症等疾病上有着上千年的历史。山楂果为药食同源，入脾胃经，具有消食化积之力，在改善高血脂症、动脉粥样硬化病变等疾病上具有很好的效果。中国药典 版中记载山楂叶具有“化浊降脂”的功效，可用于治疗心血管疾病。现代研究表明山楂叶具有改善 大鼠血糖血脂异常、抑制胰岛组织凋亡、促进胰岛 细胞分泌胰岛素等作用。本研究通过高脂高糖饲料喂养联合注射链脲佐菌素诱导建立 大鼠模型，研究山楂果、叶提取物基于 信号通路调节糖脂代谢的作用；基于中医整体观和辨证论治的特点，结合网络药理学所构建的基于疾病 表型 基因 药物的多层网络结构研究模式，分析山楂果、叶治疗 的有效成分、
5、作用靶点和作用机制。该研究为阐明山楂果、叶协同调节糖脂代谢作用及机制提供理论依据，并为山楂果、叶的深入开发提供基础研究支撑。实验材料和方法.仪器设备及试剂耗材 型冷冻离心机（美国）；化学发光仪（上海领成）；色谱柱（汉邦科技）；高效液相色谱仪（日本岛津）等。色谱级甲醇、醋酸、乙腈、四氢呋喃（天 津 科 密 欧）；对 照 品 牡 荆 素 葡 萄 糖 苷（）、牡荆素鼠李糖苷（）、牡荆 素（）、芦 丁（）、金 丝 桃 苷（），纯度均，购自中国食品药品检西北大学学报（自然科学版）第 卷定研究所。本文中试剂制备均为体积分数。.药材采集及药物溶液的制备山楂药材采自河北省承德市兴隆县，经鉴定为山里红（）的干燥
6、成熟果实和干燥叶。山楂果去核粉碎，乙醇加热回流，得滤液，连续 次。合并 次滤液减压浓缩，取适量浓缩液于烧杯中，滴加 溶液调节山楂果浓缩液的 至 左右，抽滤得上清液。选择 型强碱阴离子交换树脂湿法装柱，纯水进行洗脱，洗脱液为无色后停止，再选用.的盐酸溶液洗脱，洗脱液用水饱和乙酸乙酯等体积萃取 次，无水硫酸钠脱水后减压浓缩，真空干燥即得山楂果提取物（，）。山楂叶采用 甲醇作为溶剂，加热回流.，过滤得滤液，连续提取 次，合并滤液，减压浓缩至 生药。使用 型大孔树脂，倍量 甲醇洗脱后洗脱液弃去；再 倍量 甲醇进行洗脱，收集洗脱液并减压浓缩，真空干燥即得山楂叶提取物（，）。采用中国药典中山楂果、叶项下有
7、机酸和总黄酮的含量测定方法进行测定，建立山楂叶 方法，色谱条件为：色谱柱（柱长 ，柱径.，粒径 ），.乙酸水 乙腈 甲醇 四氢呋喃（）为流动相，等度洗脱，流速为.，柱温 ，检测波长 ，测定山楂叶提取物中主要黄酮成分的含量。山楂果提取物中有机酸含量为.。山楂叶提取物中总黄酮含量为.，其中牡荆素葡萄糖苷含量为.，牡荆素鼠李糖苷含量为.，芦丁含量为.，牡荆素含量为.，金丝桃苷含量为.。.实验动物模型的建立及给药方案 级雄性 大鼠，体质量（），购自西安交通大学医学部实验动物中心，许可证号：（陕西）。饲养于西北大学实验动物中心，许可证号：（陕）。温度（），湿度（），明暗交替各 。将大鼠分为正常对照（）组
8、、模型（）组，组给予标准饲料和纯净水，组给予高脂高糖饲料和葡萄糖溶液进行饮食诱导，周后，禁食 ，腹腔注射 （溶于 .柠檬酸缓冲液中），后测定血糖，血糖值.的大鼠，认为是造模成功的，同时 组按体质量腹腔注射柠檬酸缓冲液。筛选的模型鼠随机分成 组，每组 只，分别为 组、（）组、（）组、山楂果、叶提取物混合（，）组、阳性对照盐酸二甲双胍（，）组，组动物继续给予高脂高糖饲料，口服灌胃给药，次，连续给药 周。.检测方法及指标给药结束后，进行糖耐量实验。大鼠禁食，尾静脉采血测定血糖，灌胃葡萄糖溶液（）后于.、后测定血糖值并绘制糖耐量曲线。腹腔注射浓度为 的乌拉坦溶液麻醉大鼠，测量体质量，于颈总动脉插管取血
9、，分离血浆检测总胆固醇（）、甘油三酯（）、高密度脂蛋白胆固醇（）、低密度脂蛋白胆固醇（）、胰岛素（）、总胆红素（）、碱性磷酸酶（）、谷丙转氨酶（）、谷草转氨酶（）、肌酐（）、尿酸（）、尿素（）；收集肾周脂肪及睾丸周围脂肪、肝组织，称其质量。取部分脂肪组织保存在 多聚甲醛溶液中，切片观察脂肪形态学变化，其余样本置于 的条件中。.肝脏组织蛋白测定将大鼠肝组织加入预冷生理盐水研磨混匀，离心，去上清，沉淀加入含 的 和磷酸酶抑制剂的 裂解液裂解 ，离心 ，用 蛋白测试盒测定蛋白提取液浓度。加入适量蛋白上样缓冲液，沸水变性。选择 凝胶，电泳，转膜，脱脂奶粉封闭 ，孵一抗过夜。抗体分别为、磷酸化腺苷酸活化
10、蛋白激酶（）、，按照说明书进行稀释。孵育二抗 ，最后 发光液发光，凝胶成像拍照分析蛋白表达。.数据分析使用 软件进行数据统计学分析，采用单因素方差分析来比较各组间差异性，以 和 软件进行数据分析，数据均以?表示。网络药理学山楂果叶活性成分基于 数据库挖掘并结合山楂果叶化学成分相关文献，对山楂果叶的活性成分进行筛选，通过 在线服务器、数据库预测相关靶点，去除重复靶第 期 周坤，等：基于 信号通路调节糖脂代谢的山楂果叶配伍机制点。数据库中收集这些成分的化学信息。数据库搜索 相关靶标，并对活性成分预测靶点和疾病靶点取交集作为潜在靶点。最后，使用 .软件建立药物 成分 靶点 疾病网络。数据库绘制 网络
11、，选择“”物种，选取得分大于.的高置信度目标蛋白质，得出 网络。将交集靶点基因导入 数据库，对核心靶蛋白的 功能和 途径进行富集分析。实验结果 大鼠体质量、血糖、体脂测定结果造模前各组大鼠体质量比较均匀，无差异。各组大鼠体质量处于稳定增长，相比 组，高脂饲料喂养下的 组大鼠体质量快速增长，给药结束后各给药组之间大鼠体质量无明显差异，但相比与 组大鼠有所改善（见图）；各给药组大鼠空腹血糖值与 组大鼠血糖相比均显著性下降（.），见图；相比 组，各给药组大鼠糖耐量显著增强（见图）；从图、可以看出，与 组相比，组大鼠脂肪质量和体脂指数显著升高（.），各给药组大鼠的脂肪质量和体脂指数显著降低（.）。各给
12、药组之间无显著性差异。.血液生化指标结果经过 周给药后，与 组相比，无论山楂果叶单独给药还是配伍给药均可降低大鼠血清中、含量，升高大鼠血清中 和 含量，有统计学差异，调节 大鼠血清中、指标的作用效果与单独 和 有显著差异，结果见图。注：组，.；组，.，.。体质量；空腹血糖；糖耐量；脂肪质量；体脂指数图 山楂果叶提取物对 大鼠体质量、空腹血糖、糖耐量、脂肪质量及体脂指数的影响 ，.大鼠脂肪组织形态学观察相比 组，喂养高脂饲料的 组大鼠脂肪细胞的排列较为杂乱且细胞体积增大，同一视野下细胞数量相对于 组大鼠数量减少；与 组相比，各给药组大鼠脂肪细胞的排列趋于整齐且大小较为一致，相同视野下给药组大鼠脂
13、肪细胞明显增多，其中 组大鼠脂肪细胞轮廓更清晰且细胞体积更为接近 组大鼠。结果表明，给药组对 大鼠脂组织形态有一定的改善作用（见图）。.信号通路分析由图 可知，与 组相比，组肝脏中 活性显著降低，提示 大鼠肝脏 信号通路可能受到抑制。与 组相比，西北大学学报（自然科学版）第 卷 和 组 表达显著升高（.或 .），表明 和 具有激活 活性的作用。与 组比较，、和 组大鼠肝脏中 和 蛋白的表达均显著降低（.或 .），表明 和 的活性被抑制。各给药组对比结果发现 对于 和 的调节作用均强于 和。此外，阳性药二甲双胍同样能够激活 信号通路，但相比其调节通路相关蛋白水平的能力，山楂果有机酸提取物和山楂叶
14、总黄酮提取物在调节 具有更好的调节作用。注：组，.，.；组，.，.；组，.。图 山楂果叶提取物对 大鼠血清中血脂、肝功、肾功、含量的影响 网络药理学分析结果网络药理学分析从山楂果叶中共筛选 个活性化合物（见表）。通过查阅文献共筛选出包括黄酮类成分槲皮素、山奈酚、牡荆素，有机酸类成分绿原酸、山楂酸、咖啡酸，三萜类成分熊果酸等 种在山楂果叶中含量较高的有效成分。从 和 服务器和数据库中预测到个经过去重的靶点，数据库搜索到 相关靶点 个，交集靶点 个。借助 软件构建化合物 疾病 靶点多维调控网络，共包含 个节点，条边，网络聚类系数.，网络中的节点分别代表着中药名、化学成分、疾病和作用靶点，连接线代表
15、相互作用（见图）。个共同靶点从 数据库中得到 网络，经过 软件分析并美化得到 网络图，该网络图中根据 值显示第 期 周坤，等：基于 信号通路调节糖脂代谢的山楂果叶配伍机制蛋白相互作用的紧密程度，节点的大小与 值呈正相关（见图）。值较大的几个靶点被认为是在整个山楂果叶调节 疾病过程中占据很重要的位置，如磷脂酰肌醇三激酶调节亚单位（）、血管内皮生长因子（）、蛋白激酶（）、核因子 亚基（）。分析确定了生物学过程 条，细胞组分 条，分子功能 条（见图）。结果显示，在生物学过程中，显著富集的过程有正向血小板激活、凋亡的负调控、和 级联的正调控、聚合酶启动子的转录正向调控、激酶活性的正调控等条目；在细胞组
16、分中，显著富集的有细胞质、细胞质膜、细胞溶质、细胞核等；在分子功能方面，最显著富集的包括酶结合、蛋白激酶活性、蛋白结合等功能。通路功能富集分析得到 条结果，从中筛选了与 关联较大的且具有统计学意义（.）的 条通路，主要包括 信号通路、信号通路、胰岛素抵抗等与糖脂代谢相关的多个信号通路（见图）。图 各组大鼠脂肪组织形态学变化结果（）（）注：组，.，.；组，.，.；组，.。；图 山楂果叶提取物对 大鼠肝脏蛋白的影响 西北大学学报（自然科学版）第 卷表 基于文献检索筛选的山楂果叶 种有效成分 山楂果主要有效成分山楂叶主要有效成分熊果酸（）槲皮素（）齐墩果酸（）山奈酚（）山楂酸（）表儿茶素（）咖啡酸（）牡荆素（）牡荆素鼠李糖苷（）木犀草素（）牡荆素葡萄糖苷（）异槲皮苷（）绿原酸（）金丝桃苷（）第 期 周坤，等：基于 信号通路调节糖脂代谢的山楂果叶配伍机制注：中红色椭圆为疾病名，黄色菱形为化学成分，蓝色长方形为靶点；中圆越大，值越大。靶点；网络；图 山楂果叶化学成分 靶点、网络、和 通路分析 ，结语我国山楂资源丰富，于河北、陕西、山东等地均有种植，价格低廉。传统中医认为山楂果“药食同源”，具有化