1、天道酬勤毕赤酵母发酵过程的染菌分析及预防策略曹家明 许超群 曾宪放：针对毕赤酵母Pichia pastoris在发酵过程中发生的染菌现象，按照质量控制要素及工艺流程进行全面分析。通过对工作种子库、一级种子、二级种子、滤芯、发酵罐及发酵菌体进行系统排查发现，染菌是由赛多利斯取样阀密封圈磨损及试验人员的不标准操作造成的。因而在试验操作、设备维护、车间管理、文件修订、人员培训等方面实施一系列纠正预防措施，随后进行多批次的发酵生产。结果说明，试验结果与历史数据具有高度的一致性，从而防止了染菌现象的再次发生。关键词：毕赤酵母;发酵;染菌分析;预防策略中图分类号： S182文献标志码： A文章编号：100
2、2-1302202308-0265-07收稿日期：2023-03-18基金工程：国家“重大新药创制科技重大专项编号：2023ZX09101035、2023ZX09308003;上海市“科技创新行动方案生物医药领域科技支撑工程编号：18431905600;上海市科技人才方案编号：16QB1404200。作者简介：曹家明1985，男，江苏常州人，硕士，工程师，主要从事生物药物开发、基因工程菌发酵、蛋白药物纯化等方面的研究。E-mail：caojiamingwalvax。自从Cregg等于1985年利用重组毕赤酵母Pichia pastoris成功表达外源蛋白1以来，毕赤酵母因高效表达外源蛋白、操作
3、简单、易于培养、生产本钱低廉等优点而受到科学家和工业界的青睐，目前已有超过500个蛋白在毕赤酵母中表达成功，表达产物包括干扰素、酶制剂、抗体等2-4。美国食品药品监督管理局Food and Drug Administration，简称FDA认定毕赤酵母是一般公认平安的generally regarded as safe，简称GRAS微生物，为其在医药和食品中的应用铺平了道路5。目前，人们已经在该系统中成功表达了胰岛素、弹性蛋白酶、S-腺苷基甲硫氨酸、干扰素、白细胞介素、溶菌酶等多种治疗性药物6-7。随着毕赤酵母表达系统研究的不断推进，会有更多外源蛋白在毕赤酵母中表达，从而在医学、微生物学等相关
4、领域发挥重要作用。随着发酵技术、生物反响器设计制造的开展更新，生产过程中的染菌率已经明显下降，然而染菌仍是发酵产业的最大“敌人，染菌轻者会降低产品的产率及质量，严重者会造成发酵失败，不仅会增加发酵的生产本钱，打乱生产方案，还会造成环境污染8-9。宋磊等从染菌时间、类型、范围3个方面探讨透明质酸发酵染菌的原因，提出防止发酵染菌及染菌后的补救措施10。任石苟等对乳酸生产过程中的染菌原因进行分析，提出了预防和治理措施11。李素荣等通过加强菌种、无菌用具、环境、人员培训等的管理，使染菌率由9.64%降至1.20%12。丁玮云等介绍了赖氨酸发酵染菌的危害性及由设备引起的染菌原因，并提出防控措施13。刘利
5、通过现场跟踪调查，得出设备、空气和员工操作失误引起的染菌概率最大，应该从这3个方面入手减少染菌14。目前的染菌研究多集中于抗生素、谷氨酸等传统产品在发酵过程中的染菌途径、不同发酵阶段染菌对发酵的影响及防治措施等方面9，15-16，鲜有针对药品生产质量管理标准good manufacturing practices，简称GMP环境下发酵生产中染菌排查的报道17。本研究以笔者所在公司车间在进行毕赤酵母发酵表达外源蛋白的生产过程中发现的1例染菌现象为列，对可能的染菌过程进行分析、排查，并采取相应的预防和整改措施，以期为医药企业在重组菌发酵生产中出现染菌现象时进行快速排查及预防提供一些思路。1材料与方
6、法1.1试验试剂酵母粉，购自OXOID公司;蛋白胨，购自日本制药株式会社;甘油，购自湖南尔康制药股份;胰蛋白胨大豆琼脂培养基 tryptone soy agar，简称TSA培养基平板，购自上海源培生物科技股份。1.2酵母浸出粉胨葡萄糖培养基yeast extract peptone dextrose medium，简称YPG培养基YPG培养基配方如下：20 g/L蛋白胨、10 g/L酵母粉、20 g/L甘油。用2 L锥形瓶分装1 L培养基，在30 L发酵罐中装入8 L培养基，在210 L发酵罐中装入120 L培养基，于121 灭菌20 min。1.3仪器与设备NLF22 30 L发酵罐，购自瑞
7、士比欧生物工程公司;BIOSTATC-plus 30 L发酵罐，购自赛多利斯公司;P 210 L发酵罐，购自瑞士比歐生物工程公司;立式压力蒸汽灭菌器，购自上海博迅实业;全温振荡培养箱，购自哈尔滨东联电子技术开发;显微镜，购自重庆光学仪器厂。1.4试验方法1人员操作排查。相应批次的试验人员回忆相关操作，分析可能的风险环节。2工作种子库排查。领取1支工作种子，吸取100 L，稀释一定倍数后涂布TSA平板，培养23 d后观察菌落形态，并挑取单菌落进行镜检。3一级种子排查。领取1支工作种子，接种于YPG培养基中，于 30 、200 r/min培养24 h，取1 mL发酵液稀释至一定倍数后涂布平板，培养
8、23 d后观察菌落形态，并挑取单菌落进行镜检。4滤芯检查。拆下压缩空气管路及发酵罐上的滤芯，检查外观，并进行完整性测试。5空培试验。30L发酵罐设置搅拌转速300 r/min、培养温度30 、通气量 10 L/min，不进行接种，空培72 h后，观察是否有杂菌生长现象。210 L发酵罐设置搅拌转速 300 r/min、培养温度30 、通气量100 L/min，不进行接种，观察是否有杂菌生长现象;空培48 h后，假设210 L发酵罐未染菌，那么进行甘油、甲醇补料操作，观察是否有杂菌生长现象;空培72 h后，假设210 L发酵罐未染菌，那么模拟移种操作，将30L发酵罐中未染菌的培养基按正常移种操作
9、移入210 L发酵罐中继续空培48 h，观察是否有杂菌生长现象。6接种培养。对空培正常的30 L发酵罐进行接种，按照“5空培试验中的培养条件进行二级种子培养，培养6 h后无菌取样镜检，涂布平板培养，检查是否有染菌。7菌体检查。在超净工作台中无菌刮取最近批次的发酵菌体，适当稀释后涂布于平板上，37 培养23d，观察是否有杂菌生长。8染菌判断。在培养过程中观察pH值是否有明显变化波动大于1表示变化明显，溶氧量由发酵罐自带电极测量有无明显下降波动大于20%表示变化明显，发酵液颜色是否澄清，是否有异常气味，镜检观察是否有杂菌等，假设有其中1项发生明显变化，那么认为发生染菌。2.2.8染菌调查试验小结1
10、经过试验人员的回忆与分析，存在一些不标准操作;2NLF22 30L发酵罐在进行空培、取样操作、接种操作、二级种子培养的过程中，通过取样镜检并稀释涂平板，未发现有染菌现象;3C-plus 30 L发酵罐在空培过程中发生染菌，经过对取样阀进行严格处理和更换密封圈后进行空培及二级种子培养，未发现染菌现象;4P 210 L发酵罐进行了空培、取样、移种、补料等操作，共进行160h的试验，未发现有染菌现象;5不同发酵罐最近发酵的菌体均未出现染菌;6分析染菌原因，可能是存在不标准的试验操作现象。C-plus 30 L发酵罐取样阀的设计造成密封圈极易磨损。2.3预防及纠正措施笔者所在公司的车间环境为GMP條件
11、，发酵罐均为进口的全自动发酵系统，且发酵规模远小于大宗产品，因此环境和设备所带来的影响较小。然而，由于在研发阶段一些操作未被写入相关文件中，并且一些员工入职时间短，因此笔者从生产流程和人员入手，对可能造成染菌的环节采取预防及纠正措施，并以文件的形式固定下来，并对相关人员进行了系统培训，具体措施如下。2.3.1溶液灭菌2.3.1.1摇瓶溶液的灭菌1摇瓶溶液灭菌结束后应让灭菌锅自然降温至100 以下，使压力降至0 MPa，严禁直接手动卸压，否那么会因压力下降过快造成封口膜鼓胀甚至松脱。2摇瓶溶液在用灭菌锅灭菌后应及时开盖并取出，放置于桌面或超净台内自然冷却，用75%乙醇外表消毒后置于超净工作台内，
12、不得放在水池内用纯化水冷却。2.3.1.2补料溶液的灭菌1灭菌前应将补料软管插针套筒前端旋开，并检查内部棉塞的状态，如果有变色或异味应立即更换。插针套筒顶端应防止靠近灭菌锅底部，防止灭菌过程中混入不洁净的水。2检查补料瓶呼吸过滤器的状态，如发现破损、变形、进水、变色，应立即更换。在呼吸过滤器上标明开始使用的日期，并在每次灭菌前标记灭菌的次数，重复灭菌满20次后立即更换。3与四阀组对接的隔膜阀在灭菌时应使其处于开启状态，灭菌结束取出补料瓶时应旋紧隔膜阀。4溶液在灭菌前需要确认呼吸器正常、软管已被止血钳夹紧。2.3.2摇瓶接种1接种前开启紫外灯照射摇瓶溶液的时间不少于30 min。2摇瓶用75%乙
13、醇喷洒消毒后放入超净工作台内，开启风机吹干摇瓶外壁。3用带滤芯的吸头进行接种。2.3.3将种子液转移至接种瓶中摇瓶揭开封口膜后，将瓶口立即靠近乙醇灯火焰并旋转瓶身，对瓶口进行烘烤。倒种子液时，接种瓶不应放在双人超净工作台的中间位置。2.3.4发酵准备工作1发酵罐检漏。发酵罐定期做保压测试，对于发现泄漏的地方应采取措施解决。230 L发酵罐的清洗。发酵罐的清洗要全面，将30 L发酵罐的可拆卸零部件浸泡于碱液中，包括垫圈、电极堵头、空气过滤器外壳等。30 L发酵罐的清洗过程包括3步：1用纯化水清洗干净;2用0.25 mol/L碱液浸泡2 h以上;3用纯化水冲洗干净。用碱液浸泡时，需要翻开发酵罐底阀
14、和取样阀，确认碱液与阀芯充分接触进行浸泡，在取样阀与底阀出口处连接软管并用止血钳夹紧。2.3.530 L发酵罐的灭菌在对30 L发酵罐进行灭菌的过程中，对取样阀和底阀进行同步灭菌。2.3.630 L发酵罐种子的培养在30 L发酵罐的培养过程中，应调节尾气阀门，使罐压维持在 20 kPa。2.3.730210 L发酵罐的移种1对移种管路灭菌30 min，在灭菌过程中注意观察接头局部是否有蒸汽泄露。2将移种管路接头局部的垫圈浸泡于碱液中，使用前清洗干净，如有变形或破损，应立即更换。3在移种过程中，保持30 L发酵罐的进气和排气处于通路状态，并调节尾气阀，维持罐压在50 kPa左右。2.3.8过程取
15、样1取样前后都需要对取样管路进行蒸汽灭菌，时间设为56 min。灭菌时遵循蒸汽流动方向依次翻开取样管路上的隔膜阀，灭菌结束后那么倒序关闭隔膜阀。2210 L发酵罐取样时先翻开隔膜阀，后翻开取样阀。在发酵过程中，每隔24 h通过取样镜检及平板涂布来判断是否染菌。2.3.9210 L发酵罐灭菌在灭菌过程中注意观察阀组、堵头局部是否有泄露;灭菌完成并冷却至设定温度进入保压模式后，注意观察罐压的变化。2.3.10210 L发酵罐发酵过程的补料1四阀组补料口对接后灭菌30 min。2开启补料阀组时，注意开启对应的四阀组，不要错开未灭菌的补料四阀组。3注意推阀的开启和关闭状态，防止在补料过程中软管崩开。2.3.11维护保养130 L发酵罐进气端滤芯暂定半年更换1次，每批在放罐后拆下并观察有无明显污染、变形或松动。2210 L发酵罐进气端空气过滤器暂定2批次更换1次，尾气滤芯每批次更换1次，如需延长使用次数，那么应在使用前进行完整性测试，检测合格前方可继续使用。3每个批次均对发酵罐密封圈进行检查。4每个季度均对发酵罐进行维护保养。5每个月均对超净工作台采用0.2%新洁尔灭/75%乙醇擦拭轮换进行消毒;每个月对灭菌锅内的水进行更换。2.3.12GMP管理方面