1、题 目：基于ITS序列分析的外生菌根真菌的分子鉴定研究摘 要本实验是利用采自内蒙古贺兰山的外生菌根真菌子实体作为研究对象，通过常规CTAB法对该子实体进行基因组DNA提取，并利用真菌特有的引物ITS1F和ITS4对特异的DNA片段进行PCR扩增，将扩增产物在浓度为1%的琼脂糖凝胶中电泳进行检测，并在紫外透射反射分析仪下观察检测的结果，对于较好的扩增产物利用回收试剂盒进行纯化，后将纯化产物送由上海生工进行DNA测序，将测序所得到的序列输入GeneBank数据库中的局部相似性查询（Basic Local Alignment Search Tool,BLAST)程序进行比对，列出数据库中与所测得到的
2、序列同源性较高的序列信息并进行分类鉴定，然后运用软件raxmlGUI进行系统发育树构建。最终的研究结果显示该菌种属于报道的choiromyces helanshanensis。 关键词：外生菌根真菌；ITS序列；分子生物学；鉴定AbstractIn this experiment, an ectomycorrhizal fungi collected from Helan Mountain, Inner Mongolia, was used as the research object. The extraction of genomic DNA of the fruiting body of
3、 ectomycorrhizal fungi was carried out by the conventional CTAB method. The specific primers ITS1F and ITS4 were used to amplify the specific DNA sequences by PCR amplification. The amplified products were tested by electrophoresis with a 1% agarose molecular biology grade gel, and the results of th
4、e gel were observed under the ultraviolet transmission reflectance analyzer. The better amplification products were purified by using a recovery kit. Then, the purified products were sent to Shanghai Shenggong for DNA sequencing. The sequence obtained by sequencing was input into the Basic Local Ali
5、gnment Search Tool(BLAST) program in the GeneBank database for comparsion. In the database, find out the sequences with higher homology with the sequenced sequences and perform the classification and identification. The phylogenetic tree was constructed by using the software raxmlGUI. The final resu
6、lts showed that the strain belongs to the reported Choiromyces helanshanensis in Helan Mountain, Inner Mongolia.Key words：ectomycorrhizal fungi; ITS sequence; molecular biology; identification目 录引 言11 材料与方法31.1 实验材料31.2 实验设备及药品31.2.1 试剂配方31.3 实验方法31.3.1 基因组DNA的提取31.3.2 rDNA ITS区段的PCR扩增41.3.3 PCR扩增产物
7、的回收和纯化51.3.4 DNA测序分析52 结果与分析62.1 PCR产物的检测62.2 提纯效果的检测62.3 rDNA ITS序列的同源性分析72.4 raxmlGUI系统发育树分析93 结论与讨论10参考文献11致 谢12引 言贺兰山坐落于宁夏回族自治区的西北部，是银川平原的原始屏障，也是三北防护林建设的重点地段1贺永喜.贺兰山麓野生食(药)用真菌资源调查初告J.中国食用菌,2003(03):7-9.。贺兰山植被类型比较复杂，既有标志山地所在水平地带属性的草原和荒漠，也有山地植被垂直系列中出现的针叶林和稀疏草原，还有各种灌丛、草甸和落叶阔叶林李娟.内蒙古自治区贺兰山国家级自然保护区森林
8、资源动态分析J.内蒙古林业调查设计,2013,36(01):42-43.。贺兰山是我国西北部温带草原与荒漠的分界线，同时也是连接蒙古高原、青藏高原及华北植被区系的重要枢纽。因特殊地理位置及气候条件越来越受到国内学者的重视。同时独一无二的地理位置、地形地势和天然气候条件及丰富多样的生态系统造就了贺兰山丰富的真菌资源孙丽华. 贺兰山（宁夏）大型真菌多样性及其营养成分的研究D.内蒙古农业大学,2012.。青海云杉、油松等为组分的森林大约在贺兰山2000m以上。由于贺兰山的特殊地势，对贺兰山真菌资源进行研究调查和保护发展就显得迫切需要王宽仓,查仙芳.宁夏贺兰山真菌J.宁夏农林科技,2000(S1):4
9、8-51.。菌根（Mycorrhizae）是真菌与植物的根系形成的具有一定的形态和功能的共生体许美玲,孙军德,朱教君,康宏樟.树木外生菌根真菌多样性研究方法进展J.土壤通报,2005(06):155-160.，能够促进林木吸收营养元素。外生菌根真菌（Ectomycorrhizal fungi，EMF)是森林生态系统的重要成员之一，能与6000多种树木形成菌根，对维持生态系统的功能和生物多样性具有不可代替的作用耿荣,耿增超,黄建,和文祥,侯琳,佘雕,韩其晟,龙东风.秦岭辛家山林区锐齿栎外生菌根真菌多样性J.菌物学报,2016,35(07):833-847.。面临我国林木连作后生产力明显下降的近况
10、，研究外生菌根真菌在这个过程中发挥到底着怎样的作用，首先要明确外生菌根真菌群落的组成情况和物种多样性武斌. 东北落叶松外生菌根真菌物种多样性及与土壤因子的关系D. 中国科学院大学, 2013. 。正是因为外生菌根真菌具有丰富的物种多样性，所以宿主植物才能适应各种不同的恶劣环境的影响，并能充分地利用土壤中的各种化学元素和养分。大量的研究表明，在森林的生态系统中，如果外生菌根真菌较少，则会影响森林中植被的生长和发育。外生菌根真菌能促进森林生态系统发挥其自我调节和更新功能，并协助维持森林生态系统的稳定。诸多研究表明，植被的生长通常受到重金属的胁迫，而外生菌根真菌则可产生大量的有机酸来消除这种重金属，
11、降低重金属的有害作用乌仁陶格斯,王娟,昭日格,苏楞高娃.外生菌根生态学研究进展J.安徽农业科学,2018,46(06):26-28+36.。传统的菌种的分类鉴定通常是采用形态学和解剖学相结合的方法，即以观察子实体的形态为基础，通过形态学的特征来对某个菌种进行分类鉴定。然而随着分子生物学技术的发展，分子生物学方法也越来越被广泛运用于菌种的分类鉴定，尤其是基于rDNA ITS序列分析的分子鉴定方法，为属内、种间及种内群体菌种的分类鉴定带来了巨大的便利杨智,王华伟,沙涛.外生菌根真菌的研究进展J.中国食用菌,2016,35(01):1-7.。ITS是rDNA的内转录间隔区(Internal Tran
12、scribed Spacer)，是真菌核糖体RNA基因非转录区的一部分。受到的选择压力较小，在绝大多数真核生物中有着极其广泛的序列多态性苏春丽,唐传红,张劲松.基于ITS序列的紫芝分子鉴定J.成都医学院学报,2014,9(02):121-123.。ITS具有两个显著的特点:(1）进化速度较编码区进化速度快（2）能被独立复制。因此，ITS能在比较广泛的水平上表现真菌种间变化，通常用于研究低等级，如属间、种间的系统发育关系。由于真菌种类数目繁多，依靠形态特征、生化特性等指标来鉴定真菌既需要丰富的关于真菌鉴定的经验又需要较长的检验时间，尤其是对于那些生长条件相同、形态特征又极其相似的菌种，想要通过传
13、统的形态解剖特征来完成真菌的鉴定工作是极为困难的。而基于rDNA ITS的多态性(包括长度多态性和序列多态性)的序列分析，由于可以从不太长的核酸序列中获得相对足够的信息来反映生物的亲缘关系与分类情况，因而成为真菌分类及鉴定研究的主要方向，目前已广泛应用于真菌的属种间及部分种内组群水平的系统学研究赵育卉,李连强,湛东锐,王惠,刘天行,辛志宏.盐生海芦笋内生真菌S19的分离鉴定与抗氧化发酵条件优化J.南京农业大学学报,2013,36(02):137-144.。本实验就是运用分子生物学手段，以外生菌根真菌的子实体为材料，提取DNA，利用真菌特有的引物ITS1F和ITS4，利用PCR技术对外生菌根真菌
14、rDNA的ITS序列进行扩增 张文泉. 樟子松外生菌根真菌多样性及菌根生物技术研究D.内蒙古农业大学,2013.，然后测序并与NCBI（National Center for Biotechnology Information)数据库中的信息资源进行比对以及通过系统发育树上所体现的亲缘关系，将外生菌根真菌对应到属或种的水平，对外生菌根真菌进行分类研究。从而为丰富贺兰山真菌的物种多样性及我国真菌的系统分类研究奠定基础。 1材料与方法1.1实验材料实验材料是包头师范学院植物实验室提供的采自内蒙古贺兰山的外生菌根真菌的子实体，编号为HBTTC004。1.2实验设备及药品实验设备：电泳仪(DYY-10
15、C/北京六一仪器厂)、PCR自动系列化分析仪(2720/美国ABI公司)、台式离心机(CT14D/上海天美科学仪器有限公司)、紫外透射反射分析仪（2WF-1/上海金达生化仪器厂）、电子精密天平（BS223S/赛多利斯科学仪器有限公司）、高压蒸气灭菌锅、移液枪、微波炉、电热恒温水浴箱、超净工作台。实验药品：液氮、巯基乙醇、2CTAB提取液、异丙醇、2Taq PCR Master Mix、ddH2O（双蒸水）、氯仿/异戊醇（24:1)、引物ITS1F、引物ITS4、Biospin胶回收试剂盒、Agarose-Molecular Biology Grade(琼脂糖）、5TBE缓冲液、Gold View型核酸染色剂、6DNA Loading Buffer、DL 2000 Plus DNA Marker、1mol/L Tris-HCL(PH=8.0)、0.5mol/L EDTA（乙二胺四乙酸钠)(PH=8.0)、无水乙醇、70%乙醇。1.2.1试剂配方1mol/L T