1、饲料发酵工艺对益生菌增殖及大肠杆菌数量变化的影响摘 要：以植物乳杆菌和大肠杆菌 E.colik88 为指示菌株，研究了饲料的液态转固态发酵与固态发酵两种工艺在 20 与 30 两种温度下的 pH 值变化及菌数的动态变化。结果说明：30 温度下，物料的酸度变化pH 值比 20 温度时下降的速度快、幅度大；在固态发酵过程中，液态转固态发酵的起始 pH 值低于固态发酵P0.05，但液态转固态发酵和固态发酵在发酵过程中 pH 值差异不显著(P0.05)；在 30 的发酵温度下，乳酸细菌数呈先增值后下降趋势，但液态转固态发酵与固态发酵之间差异不显著(P0.05)；在液态转固态发酵工艺下，大肠杆菌 E.c
2、olik88 菌数呈直线下降趋势，而在固态发酵工艺下，大肠杆菌 E.colik88 菌数呈先升后降，证实液态转固态工艺对原料中大肠杆菌直接产生抑菌作用。关键词：益生菌；发酵工艺；乳酸菌数；抑菌特性随着饲料中抗生素类生长促进剂在欧盟的全面禁用，饲料微生物发酵技术在动物生产中受到高度重视，欧盟已实现广泛应用。饲喂微生物发酵饲料有提高动物生长性能和改善肠道健康的作用Scholten 等，1999；Canibe 等 2023，荷兰至少有 50的猪在饲喂发酵饲料，丹麦有 30以上的母猪饲喂发酵饲料，母猪泌乳期的使用更达 70%以上。另外，法国、瑞典、西班牙也陆续开始使用微生物发酵饲料。饲料发酵目前主要采
3、用液态发酵和固态发酵两种工艺，液态发酵Submerged Fermentation,SmF具有周期短、易控制、微生物的繁殖重复性强等优点，但需要配套昂贵的系统设备，难以被群众所接受；固态发酵Solid StateFermentation,SSF具有培养基简单，基料来源广泛；投资少，能耗低，操作方便等优点，但劳动强度大，难以与现实规模化养殖生产所需的系列化日粮配合加工结合。为此，本课题设计饲料液态发酵转固态发酵新工艺并展开了系列研究。试验以植物乳杆菌Lactobacillus plantarum 和致病性大肠杆菌 E.colik88 为指示菌株，研究在液态转固态发酵饲料中目标益生菌和指示菌的动态
4、变化情况，为建立适合我国养殖生产条件的生物发酵饲料新工艺提供科学依据。1 材料与方法1.1 试验材料1.1.1 菌株来源植物乳杆菌由湖北省农业科学院畜牧兽医研究所别离、鉴定并保存；大肠杆菌 E.colik88 购于中国兽医药品监察所。1.1.2 培养基选择及菌株培养参照何涛等介绍的方法，植物乳杆菌采用 MRS培养基，大肠杆菌 E.colik88 采用伊红美兰培养基培养。1.1.3 主要仪器设备超净工作台苏州安泰 SW-CJ-1CU 型、酸度计(上海理达 PHS-25C 型)、高压蒸汽灭菌锅上海申安ZDX-35BI 型、恒温培养箱 黄石恒丰 SP-01 型、微型发酵瓶(罐头瓶)。1.1.4 发酵
5、基料设计原那么以生长后期仔猪配合饲料为发酵的根底原料，即不含预混料的配合饲料配方见表 1。在此根底上，制备如下三种发酵基料，固态发酵基料：为不含微量元素、维生素、矿物质的配合饲料；液态发酵基料：玉米、豆粕按质量分数 1： 3 混合均匀；液态转固态发酵基料：为固态发酵基料中减去液态发酵基料的局部。饲料工业2023 年第 32 卷第 5 期试 验 研 究30表 1 固态发酵基料配方原料名称玉米豆粕鱼粉麸皮膨化大豆比例%66183581.2 试验方法1.2.1 试验设计与方案采用 2 因子试验设计。研究了2 种发酵温度20 ，T1；30 ，T2下，不同发酵工艺液态转固态发酵和固态发酵对 pH 值及菌
6、落数的影响，设计方案见表 2。表 2 设计方案发酵温度T120T230发酵工艺液态转固态发酵固态发酵液态转固态发酵固态发酵1.2.2 试验操作方法1.2.2.1 液态转固态发酵工艺操作方法第一阶段液态发酵：称取 20 g 液态发酵基料于微型发酵瓶中，以料水比 1： 3.5 参加 70 g 水，按106cfu/g 物料接入植物乳杆菌，在 25 的恒温条件下静置培养 48 h。第二阶段固态发酵：直接在液态发酵料中参加80 g 的固态配合料，搅拌均匀，使终水分在 40%左右。并按每 106cfu/g 物料接种 E.colik88，密封置恒温培养箱中培养。1.2.2.2 固态发酵工艺操作方法与液态转固
7、态发酵工艺的第二个阶段同时进行，具体操作如下：称取 20 g 液态发酵基料和 80 g 的固态配合料于微型发酵瓶中，参加一定质量的水，使终水分在 40%左右，按 106cfu/g 物料分别接种植物乳杆菌和 E.colik88，搅拌均匀，密封置恒温培养箱中培养。1.2.3 指标测定分别于固态发酵开始后第 0、24、48、72、120、168 h无菌取样，进行 pH 值和微生物的测定。pH 值测定：取鲜样 10 g，用 100 ml 蒸馏水浸提 12 min 后，经纱布过滤，水浸液当即用酸度计测定 pH值。微生物测定采用 10 倍稀释法，植物乳杆菌测定应用 MRS 琼脂培养基，37 培养 36 h
8、，大肠杆菌 E.colik88 测定采用 EMB 培养平板，37 培养 24 h。1.3 数据处理微生物及 pH 值数据采用 SAS6.12 的 t-test 过程进行两组均数的差异显著性检验。2 结果与分析2.1 发酵过程中 pH 值的动态变化2.1.1 不同发酵工艺对 pH 值的影响见表 3在发酵过程中，液态转固态发酵起始0 hpH 值明显优于固态发酵，差异显著P0.05。在随后的发酵时间里，2 个发酵温度下，液态转固态发酵和固态发酵 pH 值差异都不显著(P0.05)。这主要是因为液态转固态发酵工艺中接种的益生菌株植物乳杆菌发酵过程中产生的乳酸、乙酸等有机酸成分，在液态转固态发酵时直接降
9、低了饲料的 pH 值。因而随着发酵时间的延长，pH 值趋向一致，所以差异不显著。2.1.2 不同发酵温度对 pH 值的影响见图 176543210pH值0 2448 72 120238液态转固态发酵 T1液态转固态发酵 T2固态发酵 T1固态发酵 T2时间h图 1 不同发酵温度对 pH 值的影响1684.050.05a3.960.04a3.940.03a4.010.02a表 3 不同发酵处理对 pH 值的影响05.820.02a6.400.03b5.820.02a6.400.03b244.540.10a4.490.01a4.220.04a4.190.01a484.280.06a4.290.05
10、a3.970.03a3.960.05a724.150.02a4.150.02a3.860.01a3.870.02a1203.950.01a3.940.06a3.900.04a3.860.04aT1液态转固态发酵固态发酵T2液态转固态发酵固态发酵项目培养时间h注：同一温度下同列标注字母不同者差异显著P0.05。 下表同。杨雪海等：饲料发酵工艺对益生菌增殖及大肠杆菌数量变化的影响试 验 研 究31从图 1 可见，液态转固态发酵和固态发酵在 T1、T2 两个发酵温度下随发酵时间的延续均表现出逐渐下降的趋势，在 120 h 时降到最低，随后出现轻微的上升。在 24、48、72 h 三个时间点两种发酵工
11、艺的pH 值T2 明显低于 T1P0.05，在随后的时间未表现出明显的差异(P0.05)。2.2 发酵过程中植物乳杆菌菌数变化2.2.1 不同发酵工艺对植物乳杆菌菌数的影响见表 4从表 4 可知，发酵温度为 20 T1时，48 h 以前2 种发酵工艺的植物乳杆菌菌数差异显著 P0.05，72 h 以后的各点差异不显著；而发酵温度为 30 T2时，24 h 以前 2 种发酵工艺的植物乳杆菌菌数差异显著P0.05，24 h 以后的各点差异不显著。2.2.2 不同发酵温度对植物乳杆菌菌数的影响见图 2121086420菌数(logcfu/g)0 2448 72 120238液态转固态发酵 T1液态转
12、固态发酵 T2固态发酵 T1固态发酵 T2时间h图 2 不同发酵温度对植物乳杆菌菌数的影响从图 2 可知，在 72 h 以内，液态转固态发酵和固态发酵植物乳杆菌数菌数在 T1、T2 发酵温度下未表现明显差异(P0.05)。但在随后的发酵时间里，表现出显著的差异P0.05。T1 发酵温度下的植物乳杆菌菌数优于 T2 发酵温度。2.3 发酵过程中 E.colik88 的菌数变化2.3.1 不同发酵工艺对 E.colik88 菌数的影响见表 5由表 5 可见，在 T1 发酵温度下，液态转固态发酵工艺和固态发酵工艺大肠杆菌 E.colik88 菌数表现出较大的差异。液态转固态发酵大肠杆菌 E.coli
13、k88 呈直线下降趋势，在 72 h 降到检测限以下，固态发酵那么表现为先上升后下降趋势，固态发酵在 120 h 才降为检测限以下。在 T2 发酵温度下，2 种发酵工艺大肠杆菌 E.colik88 菌数在发酵 24 h 时差异显著P0.05)，随后均降为检测限以下。2.3.2 不同发酵温度对 E.colik88 菌数的影响见图3从图 3 可见，液态转固态发酵大肠杆菌 E.colik88 的菌数在 T1、T2 发酵温度下，呈直线下降趋势，在 T1 温度下 72 h 降到检测限以下，而在 T2 温度下48 h 就降到了检测限以下。固态发酵 E.colik88 菌数那么表现为先上升后下降，在 T1 温度下，48 h 到达最高值，随后出现下降，120 h 降到检测限以下，在 T2 温度1689.590.17a9.540.20a8.910.12a8.930.09a表 4 不同发酵处理对植物乳杆菌菌数的影响logcfu/g08.200.20a6.150.15b8.200.20a6.150.15b249.530.10a9.410.11b9.630.23a9.490.14b489.620.08a9.470.09b9.590.09a9.570.21a729.630.23a9.540.14a9.600.18a9.530.05a1209.560.14a9.560.17a8.860.08a8.930.