1、“海大1号”长牡蛎新品种四倍体的诱导及单体牡蛎培育模式的优化研究摘要 前言 牡蛎又称海蛎子，蚝等，是一种世界性分布性的贝类，在大多数海域都有分布，牡蛎营养丰富肉质细嫩被赞誉为“海中牛奶”，牡蛎富含蛋白质、胆固醇、钙、铁维生素等营养成分，深受人们的喜爱，是重要的养殖贝类，我国具有广阔的海上疆域，拥有长达18000km的海岸线，广阔的海区条件和丰富的饵料使我国的贝类资源丰富，并为我国贝类养殖业的发展提供了良好的条件，我国的牡蛎养殖业可以追溯到宋代的插竹养殖，经过多年的发展牡蛎养殖已成为是我国养殖业的重要组成部分，我国的牡蛎养殖业发展已经较为成熟，自然海区的半人工采苗和工厂化室内人工育苗为牡蛎养殖业
2、提供了充足的苗种供应，筏式养殖滩涂播养等养成技术保证了成体牡蛎的供应，消费者的认同保证了牡蛎的销路，牡蛎养殖业创造了巨大的经济效益和社会效益，但是随着养殖业的蓬勃发展，种质衰退、海区自然资源减少、养殖海区污染，引种混乱，发展路线低端牡蛎单位价值较低等问题日益凸显，制约了我国牡蛎养殖业的发展。培育出生长更快，风味更好，抗逆能力更强的养殖新品种成为解决上述问题的理想方法。2014年3月24日，农业部公布了第五届全国水产原种和良种审定委员会审定通过的15个水产新品种，由中国海洋大学水产学院贝类遗传育种研究室培育的长牡蛎“海大1号” 获得了水产新品种证书。长牡蛎“海大1号”是我国培育的第一个牡蛎新品种
3、，填补了我国牡蛎良种培育的空白，对实现海水养殖良种化，推动牡蛎养殖业持续、稳定、健康发展将起到重要促进作用。 “海大1号”是来以从山东乳山海区养殖的长牡蛎为基础群体，使用群体选育的方法经过连续6代选育而成的，主要的选育指标是生长速度和壳形，该新品种具有生长速度快、壳型规则等特点，在相同的养殖条件下，15月龄平均壳高比普通长牡蛎苗种提高16.2%，总湿重提高24.6%，出肉率提高18.7%，壳形较美观，整齐度明显的高于普通商品长牡蛎，由于其生长快、个体大、壳形规则的特点，一经推广就被养殖户广泛接受，创造了良好的经济效益。但是在繁殖季节，由于牡蛎的性成熟及精卵的排放会导致牡蛎的生长停滞，肉质下降等
4、问题，在繁殖过后，又会因为体质虚弱导致大量死亡，影响了牡蛎在繁殖季节的口味和产品供应，而由于三倍体牡蛎的育性差，不会出现类似的情况（王昭萍等，2000；曾志南等，1999；），可以弥补传统二倍体牡蛎养殖过程中在繁殖期出现的问题，同时三倍体牡蛎生长速度较快，个体较大可以缩短养殖周期具有较高的经济价值（王昭萍等，1998；胡庆明等，1997；曾志南等，1999 Allen S K and Downing S L；Stanley J G et al 1984；Davis J P，1989），目前可以通过多种理化方法直接诱导牡蛎三倍体，常采用的化学诱导剂有6-二甲基氨基嘌呤、细胞松弛素B、咖啡因等，或
5、者使用温度休克法或水静压等物理方法诱导，但是大多数方法三倍体诱导率无法达到100%，而且直接诱导获得三倍体的方法不稳定，诱导过程易受到外界环境以及操作者水平的影响,各种理化处理方法还会对受精卵的存活产生影响，影响幼虫的孵化。而且三倍体牡蛎不能进行自群繁殖，想要获得三倍体苗种需要进行重复操作，工作量较大。对此理想的解决方法就培育出四倍体牡蛎，理论上四倍体牡蛎和正常的二倍体牡蛎杂交可以获得100%的三倍体后代（Guo X et al，1996；阙华勇等，2003王昭萍等，2004），而且四倍体牡蛎可以正常繁殖,可以建立稳定的四倍体群体（施坤涛等，2006）,可以更加简单有效的获得三倍体，有利于三倍
6、体贝类的产业化推广。由于养殖环境、品质等因素, 我国的牡蛎价格相对较低, 仅为国际市场价格20%左右，为了提高牡蛎的经济价值，人们逐渐开始关注单体牡蛎的养殖，单体牡蛎具有形状规则，大小均匀，方便收获、加工和运输的优点，而且单体牡蛎可以充分的利用水体，方便控制养殖密度，目前,国际上发达国家的牡蛎养殖主要采用单体牡蛎养殖的方式, 而我国单体牡蛎的研究起步相对较晚，单体牡蛎发展较为缓慢，单体苗种的供应和配套的养殖设施和技术都不甚完善。本次实验将以“海大1号”长牡蛎新品种为研究对象，通过多种方式，探讨“海大1号”长牡蛎新品种四倍体的诱导方式，为海大1号长牡蛎新品种的多倍体育种提供理论依据，同时实验以肾
7、上腺素诱导获得的对海大1号长牡蛎新品种单体牡蛎稚贝为实验材料，从培育密度、水循环方式等方面入手寻找一种适宜的单体养成模式，提高单体牡蛎稚贝的存活率和生长速度。第一章文献综述第一节 “海大1号”长牡蛎新品种四倍体的诱导1 贝类育种的研究现状 为了创造更高的经济效益，解决牡蛎养殖业中暴露出来的一系列问题，科研工作者一直致力于具有优良性状的新品种的培育和推广，目前常见的新品种培育手段有选择育种技术、杂交育种技术、雌核发育育种技术、雄核发育育种技术、多倍体育种技术等。 选择育种技术：选择育种又称系统育种，是一种最基本的育种方法，通过对原始品种进行有目的有计划的反复淘汰选择，选择出性状可以稳定遗传的符合
8、人们需要的新品种，是以现有品种在繁殖过程中的自然变异作为原始材料的育种方法。在贝类选择育种研究方面选择的目标大都是选择出生长快速、规格大、抗逆性强、外形美观的品种。我国比较成功的选择育种的案例主要有包振民等选育出的栉孔扇贝新品种“蓬莱红”，李琪教授选育的长牡蛎新品种“海大1号”等。杂交育种技术：杂交育种指不同种群、不同基因型个体间进行杂交，并对其杂种后代进行培育和选择最终育成新品种的方法。杂交育种是一种经典的育种方法，其应用非常广泛，在农作物方面全球约有90%的育种是杂交育种近年来国内外的专家做了大量的工作，取得了一定成果，1995年Heath研究发现虾夷扇贝和西北盘扇贝的杂交后代的抗派金氏虫
9、病能力较强，吕豪开展了大连湾牡蛎和太平洋牡蛎杂交的实验，实验结果证明两种牡蛎间的杂交是可行的（吕豪等，1994）。雌核发育育种技术：雌核发育是指用遗传失活的精子激活卵，卵仅靠雌核发育成胚胎的现象，精子并不参与合子的形成，因为这种胚胎只有正常个体一半的染色体，所以胚胎并不能正常存活，但通过抑制极体的释放或者抑制卵裂的方法等可以使细胞核核恢复到正常的染色体，从而可以正常的存活，雌核发育技术中主要使用紫外线照射使精子的遗传物质失活，通过雌核发育得到的二倍体是纯合的，有利于快速的建立高度纯合的品系，因此受到了科学家的关注。雌核发育育种技术在鲶鱼、罗非鱼、真鲷等经济鱼类中取得了成功，在贝类中雌核发育的研
10、究相对滞后，但也取得了一些成果，李琪等成功诱导出了太平洋牡蛎雌核发育二倍体。但是人工诱导牡蛎雌核发育得到的幼虫存活率较低，培养至成体的难度较大。雄核发育育种技术：与雌核发育相似，雄核发育是卵子失去遗传活性仅靠精子的遗传物质进行发育的方式，诱导后可以通过抑制第一次卵裂获得可存活的二倍体个体，也可以通过两个精子融合获得二倍体个体在贝类中，雄核发育的诱导研究已经在长牡蛎和栉孔扇贝中开展，但是没有获得可以成活的雄核发育二倍体。多倍体育种技术：多倍体通常指体细胞中含有三个或三个以上染色体组的生物个体，真核生物形成配子时进行减数分裂，得到四个染色体数目减半的配子，贝类的精子在排放时已经完成了整个减数分裂的
11、过程，但是卵子并没有完成整个减数分裂的过程，在排放时一般处于减数第一次分裂的前期或中期，在受精后才能继续进行减数分裂，最终才能受精，这一特殊现象为贝类的多倍体育种操作提供了可能性。 目前贝类多倍体育种的研究已经取得了很大的进展（Guo X and Allen S K，1994a；Guo X and Allen S K，1994b；Stanley J G et al，1981；Shen Y P et al，1993，Quillet E, Panelay P J et al，1986；Nell J A et al，1995；Mason K M et al，1988；Chaiton J A et a
12、l，1985； Komaru A and Wada K T，1989），诱导技术也日渐成熟，目前贝类三倍体主要通过各种理化学方法来抑制受精卵第二极体的释放获得，化学诱导方法主要是使用细胞松弛素B、6-二甲氨基嘌呤、咖啡因等化学诱导剂，常用的物理诱导方法有温度休克法和水静压化学方法，在太平洋牡蛎（王昭萍等，2000；Allen S K et al，1986；Yamamoto S et al，1988； Allen S K and Bushek D，1992，于瑞海等，2002a；于瑞海等2002b；于瑞海等，2003；Akashige S and Fushimi T，1992；隋锡林等1997；
13、田传远等，1998；田传远等，2000；田传远等，1999a；田传远等，1999b；田传远等，1999c；田传远等，1999d；王菊生等，1999；于瑞海等，1994；于瑞海等，2001）、美洲牡蛎（Stanley J G et al，1981）、近江牡蛎（杨春玲等，1981）、大连湾牡蛎（梁英等，1994）、栉孔扇贝（王清印和杨爱国，2000，王子臣等，1990；杨爱国等，2000）、虾夷扇贝（王昭萍等2009；常亚青等2001a；常亚青等2001b）僧帽牡蛎（曾志南等，1994）皱纹盘鲍（Arai K et al，1986；顾勇杰等2010）多等种贝类中这些诱导方式都有被研究，但是这些诱导
14、方式都存在一定的缺陷，而四倍体牡蛎和二倍体杂交可以产生三倍体，理论上讲这种方式可以获得100%的三倍体后代，而且操作简便易行，避免了使用理化处理对胚胎造成的不良影响，理论上讲可以为贝类三倍体产业化提供一条简便易行的途径，但是这种方法需要培育贝类四倍体，人们对贝类四倍体育种的研究比贝类三倍体的研究要晚,贝类四倍体的诱导难度也更大。1988年,Stephens等通首次过抑制太平洋牡蛎受精卵第一极体的释放获得了四倍体幼虫（Stephens L B and Downing S L，1988），而后国内外学者对太平洋牡蛎、美洲牡蛎（Supan J E et al，2000）、栉孔扇贝、近江牡蛎（Alle
15、n S K et al，2003；容寿柏等，1992）、虾夷扇贝、合浦珠母贝（孙振兴等，1998）、贻贝（蔡国雄，1996）、地中海贻贝、菲律宾蛤仔、皱纹盘鲍（孙振兴等，1998）、食用牡蛎（Gendreau S and Grizel H1990）等10余种贝类进行了四倍体育种研究，虽然在实验中都获得了四倍体胚胎或幼虫,但有四倍体成体存活的仅在栉孔扇贝、地中海贻贝、和菲律宾蛤仔中有报道（王昭萍等，2004）。1994年,Guo和Allen成功的获得了存活的四倍体太平洋牡蛎（Guo X and Allen S K，1994），他们对之前诱导四倍体失败的原因进行了分析，并尝试利用太平洋牡蛎三倍体的
16、卵子与正常精子受精后抑制第一极体来诱导四倍体，最终获得了成功,并将四倍体与二倍体杂交生产全三倍体的方法应用于生产中。此后,利用这种方法又在合浦珠母贝和美洲牡蛎（Guo X et al，2002）中培育出存活的四倍体。2贝类多倍体育种原理 一般情况下，贝类都是二倍体生物，既体细胞内包含有两个染色体组，而多倍体指体细胞中含有多个染色体组的个体，通常使用物理或者化学方法改变正常二倍体受精卵的染色体组数目，经过发育后获得多倍体。贝类的精子在排放时己经完成了整个减数分裂过程,而卵子在排放时一般停止在第一次减数分裂的前期或中期，并没有完全完成减数分裂,只有在受精后才会完成剩余的减数分裂过程，完成两个极体的释放、雌雄原核的融合，然后进入第一次有丝分裂阶段，正是卵子的这种独特的减数分裂过程为贝类多倍体育种操作提供了有利的时机和条件。基于贝类独特的减数分裂过程人们可以方便的通过抑制极体的释放来影响受精卵体内染色体的行为方式获得贝类多倍体，除抑制极体的释放外还可以通过各种理化手段抑制卵裂、细胞融合，人工雌核发育等方式影响