1、细胞培养系列方法【实验前准备】（1）实验前准备好高压的离心管、冻存管、1ml/100ul枪头、PBS溶液。（2）清洁超净工作台面，照紫外30分钟；同时根据需要将培养基、胎牛血清、胰酶PBS液、双抗置于室温下复温。细胞的冻存与复苏【实验用品】（1） 材料：培养的贴壁细胞（70%-80%融合）、于液氮中冻存的细胞（2） 试剂： PBS液、0.25%胰蛋白酶液、DMEM培养基、胎牛血清、二甲亚砜（DMSO）、双抗（3） 设备：培养瓶、巴氏吸管、15ml离心管、1.5ml冻存管、盛酒精的喷壶、酒精灯、水浴锅、CO2培养箱、离心机、液氮灌、倒置显微镜、超净工作台。试剂配制：（1）完全培养基含90%DME
2、M培养液加10%的胎牛血清加1%的双抗。（2）冻存液含80%的DMEM培养基加10%的胎牛血清加10%的DMSO，用吸管混匀，置于4冰箱中备用。细胞的冻存(1) 依照传代的方法用0.25%胰蛋白酶液对处于对数生长期的单层细胞进行消化。(2) 收集消化细胞于离心管中，800-1000r/min离心5min。(3) 弃上清液，加入适量冻存液，用吸管吹打细胞制悬，调整细胞密度为5*106-1*107个/ml。(4) 每个冻存管分装细胞悬液1.5ml，旋紧冻存管的盖，并用封口膜密封。(5) 在冻存管上标明细胞的名称、冻存时间、冻存人名等。(6) 将冻存管置于如下条件下逐步加以冻存：4,0.5h-20，
3、1h-80，过夜转入液氮灌中。细胞的复苏（1） 准备水浴锅，调温度至38。打开离心机。（2） 用止血钳从液氮灌中取出细胞冻存管1只，迅速将其置入38水浴锅中，不断摇动使冻存的细胞悬液尽快融化。（3） 用酒精棉球擦拭冻存管，放入超净工作台中。（4） 将已融化的细胞悬液用吸管移入离心管中，加10倍体积的DMEM培养基，吹打混匀。（5） 1500r/min离心4min，弃上清液。（6） 加入培养液吹打沉淀的细胞，使其悬浮，对细胞进行计数。（7） 按5*105个/ml的细胞浓度，将细胞接种在培养瓶中，置于培养箱中培养。（8） 24h后取出培养瓶，观察细胞生长状况。【注意事项】（1） 对数期的细胞增值能
4、力强，冻存后生存率较高，因此，在进行细胞冻存时，应尽量选择处于此期的细胞加以冻存。（2） 为了保证复苏后细胞的存活率，复苏接种时，细胞的浓度不能太低，最好控制在5*106-1*107个/ml，这样才能保证复苏成功。（3） 冻存管的瓶盖应封盖严密，以免复苏时细胞外溢。（4） 复苏时，从液氮取出冻存管到水浴中融化的过程要快，否则会导致冰晶的形成，伤害细胞。同时，一次复苏的冻存管数量不要太多，否则会引起水浴锅中传热不佳，延缓冻存的细胞悬液融化的时间。（5） 为防止液氮冻伤，注意戴上防护手套。【实验结果及分析】经复苏刚接种的细胞是悬浮于培养基中的。复苏成功的细胞24h左右可贴壁，48h后即可开始生长、
5、增殖。复苏不成功的细胞，将继续悬浮于培养液中，不能贴壁。细胞的传代培养【实验用品】 （1） 材料：原代培养的肝细胞、原代培养的外周血淋巴细胞（2） 试剂：PBS液、DMEM培养基（含10%小牛血清）、0.25%胰蛋白酶消化液（3） 设备：25ml培养瓶、吸管、离心管、酒精棉球、酒精灯、离心机、倒置显微镜、超净工作台、C02培养箱【实验方案】 1. 贴壁细胞的传代培养（1） 用吸管吸出原代培养的肝细胞培养瓶中培养液。（2） 向瓶内加入适量的PBS液，轻轻摇动后倒掉。（3） 每25ml的培养瓶内加入0.25%胰蛋白酶消化液1ml，消化液的量以覆盖整个细胞培养面为宜，置于37的培养箱环境中。轻轻摇动
6、培养瓶，在倒置显微镜下对培养细胞进行观察，当细胞胞质回缩、细胞间隙增大时，迅速将消化液吸出。（4） 加入PBS液于培养瓶中，轻轻转动培养瓶，然后用吸管将溶液吸出，加入含血清的培养液终止消化。（5） 用吸管吸取培养液，反复轻轻吹打瓶壁，制备细胞悬液。吹打的部位应均匀，可按从上到下、从左到右的顺序进行，保证瓶底各个部位的细胞均能被吹到。此外，吹打时不能用力过猛，尽量不出现气泡，以免损伤细胞。（6） 将吹打后的细胞置于倒置显微镜下观察，当发现原贴壁的细胞均已悬浮于培养液中，成片的细胞已分散成小的细胞团或单细胞，即可终止吹打。（7） 收集细胞悬液于离心管中，1000r/min，离心5-8min，去除上
7、清。（8） 细胞计数，按照1*105-1*106个细胞的密度接种细胞于新培养瓶中。2. 悬浮细胞的传代（1） 将原代培养的外周血淋巴细胞连同培养液一并转移到离心管中。（2） 800-1000r/min离心5min，去除上清液。（3） 加新的培养液到离心管中，吸管吹打、制悬。根据细胞的数量多少，将细胞悬液按1:2或1:3的比例分别接种于新的培养瓶中。【注意事项】 （1） 消化过程中需根据培养细胞形态的变化来严格控制消化时间。当胞质回缩、细胞间的连接变松散等情况出现时，应终止消化。因上皮样细胞彼此间连接较为紧密，其消化时的时间通常比成纤维细胞长。此外，首次传代的细胞与已建系的细胞相比，也需要更多的
8、消化时间。（2） 首次传代的细胞因需适应新的环境，可适当增加其接种量，以促进生存与增殖。（3） 在对细胞进行吹打时，不能用力过猛，尽量不出现气泡，以免损伤细胞。（4） 传代培养的过程通常较长，细胞被污染的可能增加，因此，必须严格进行无菌操作。【实验结果及分析】 用倒置显微镜观察可见接种24h后，大多数肝细胞已贴附于培养瓶底部，有少数细胞悬浮于培养基中。48h以后，细胞开始增殖、细胞的数量增多，在接种的肝细胞或肝细胞团周围可见新生细胞长出，这些细胞内含物少而较为透明，胞体轮廓通常较浅。96h以后，培养细胞数量明显增多，并逐渐汇合，细胞轮廓清晰、可见。细胞转染【实验用品】 细胞、6孔板、血清、培养
9、基DMEM、OPTI-MEM、GSK-3/wt的质粒、Lipofectamine2000、GSK-3/wt的质粒、链霉素/青霉素（双抗）、FCS（小牛血清）、PBS（磷酸盐缓冲溶液）、胰酶1. 细胞的准备实验前一天，将细胞接种入6孔板中，每孔中培养基的体积为1ml，细胞环境控制在37、5% CO2培养箱中培养24小时。待细胞达到90%丰度时，准备转染，在转染前一晚换新鲜的有血清培养基，使细胞状态良好。2.转染GSK-3/wt的质粒(1) 准备无血清培养基DMEM，OPTI-MEM，转染试剂Lipofectamine2000。(2) 转染前一小时弃去培养板中的旧培养基，换预先预热的无血清培养基。
10、(3) 根据Lip-2000转染说明书算出所需要的Lip-2000的体积，根据各转染质粒的浓度算出各自所需体积见表2。 表2 所用质粒和转染试剂的量Culture VesselSurface AreaPer Well(cm2)Relative SurfaceArea(vs.24-well)Volume of PlatingMediumDNA(ug) andDilution Volume(ul)Lipofectamine2000(ul)And DilutionVolume(ul)6-well1052ml4.0ug in 250ul10ul in 250ul(4) 将质粒加入OPTI-MEM，轻轻
11、混匀。(5) 将Lipofectamine2000加入OPTI-MEM后轻轻混匀后，并计时孵育5分钟。(6) 将质粒加入Lipofectamine2000中，轻轻混匀后，计时孵育20分钟。(7) 20分钟后缓慢将Lipofectamine2000-质粒混合物加入培养孔中。(8) 37、5% CO2培养箱中培养24-48小时。(9) 提取细胞蛋白。注意事项（1） 传代细胞的准备细胞在转染前24h传代，待细胞密度达90%丰度时即可进行转染。如果转染前细胞生长不足12h，细胞就不能很好地吸附在培养皿上，与脂类接触时易于脱落。（2） 用Lipofectin转染时，不要用聚丙烯试管，因为Lipofect
12、in中的阳离子脂类会与聚丙烯发生非特异结合，而影响转染结果。（3） 在添加DNA-脂质体混合液前，用无血清培养液充分洗涤转染细胞很重要，因为血清会强力抑制转染；有些胞外基质复合物，如硫酸蛋白聚糖，也可抑制转染。（4） GFP表达的影响因素主要与转染时的温度、PH值和观察时间有关。同一表达载体转染同一种细胞后，分别在33和37条件下培养，则33条件下培养者可观察到较强的荧光，而37条件下培养者荧光较弱，其原因可能是37时三肽环状结构不易形成。培养液的PH值也显著影响GFP的荧光特性，转染后的细胞于33、5%CO2条件下培养，在培养液为碱性时荧光较强，培养液为酸性时荧光减弱。荧光强度一般在转染后48h最强，这可能是一方面与GFP的表达量有关，另一方面与细胞的生长状态有关。因此，在实验中应严格控制转染时的温度、PH值和观察时间，以获得较好的实验结果。