1、项目名称：多能干细胞定向分化的表观遗传学调控网络首席科学家：沈晓骅 清华大学起止年限：2012.1至2016.8依托部门：教育部一、关键科学问题及研究内容、拟解决的关键科学问题干细胞分化和个体发育伴随着表观遗传状态、染色质结构和基因表达的改变。多能干细胞（包括ESCs和iPSCs）代表哺乳动物细胞的一种最初状态 (ground state)，被看作是了解分化过程的起点和关键。因此，对多能干细胞定向分化和其中的分子及表观遗传学调控的研究是生命科学和再生医学领域的核心。本项目要探索的最终科学问题是：表观遗传机理如何控制多能干细胞的定向分化？表观遗传机制逐步限制细胞分化和发育的潜能。多能性干细胞在分
2、化过程中必须经历一系列表观遗传状态的改变和中间状态直至谱系确立。在此过程中，表观遗传图谱是如何建立的？换而言之，组织特异性的信号因子、转录因子和RNA分子是如何作用于表观遗传酶机器，引导其建立细胞类型特异性的表观遗传修饰图谱？一旦图谱建立，细胞特有的表观遗传修饰图谱是如何解读的？即细胞特有的表观遗传修饰图谱是如何决定基因表达和细胞谱系命运的？多能性干细胞受内、外信号的影响而选择不同命运。那么，多能干细胞在分化成不同组织类型的细胞过程中，表观遗传调控网络有何异同？另外，细胞培养并不能完全反映个体发育的规律。那么，同组织类型的细胞在体外分化和体内个体发育过程中的表观遗传调控网络有何异同？虽然小鼠是
3、研究干细胞分化和哺乳动物发育极佳的模式动物，但是干细胞在再生医学中的应用需要对人类的组织细胞分化有很好的认识。那么，从进化角度来看，表观遗传调控网络在人和小鼠等物种间有何异同性？如何指导人类多能干细胞在体外高效定向分化为近似于体内发育的各种功能细胞，并促进它们的功能成熟及提高修复损伤器官的能力？寻找这些关键科学问题的答案，将加深对干细胞定向分化和生命个体发育调控规律的认识，为建立能应用于再生医学的定向分化技术体系奠定基础。、主要研究内容围绕以上科学问题，我们以表观遗传学调控为中心，综合运用遗传学、分子生物学、生物化学、蛋白组学及基因组学等系统生物学技术，对体外和体内干细胞分化过程展开系统、深入
4、的分析。首先，以多能干细胞向包括神经外胚层、心血管中胚层等体细胞和生殖细胞的分化为模型，在已建立的分化体系的基础上，利用报告基因分离出高纯度的各分化组织细胞系。在以上不同的分化过程中，构建以表观遗传因子为中心的分子调控网络，解析单细胞及多细胞的全基因组表达谱和表观遗传修饰谱，研究信号通路、转录因子、非编码RNA和表观遗传因子之间的相互作用，以及这些互作对基因表达和细胞命运的影响。这些以表观遗传因子为中心的蛋白-RNA-DNA相互关联的机制及其对全基因组转录谱的影响作用，我们通称之为表观遗传调控网络。我们将不仅从宏观系统水平上认识分化过程中的表观遗传学、转录和转录后调控，而且从分子水平上深入研究
5、几个关键转录因子、表观遗传学酶机器、microRNA和长链ncRNA对以上分化过程的影响。通过对不同分化系统的比较，了解不同组织器官的细胞谱系是如何被确立的，寻找影响定向分化的共通的和特异的调控机制。利用报告基因、基因敲入和敲除的小鼠模型，研究表观遗传调控在体内组织发育中的作用。通过从分化组织细胞类型、动物体内外和物种进化三个维度上比较表观遗传调控网络的异同，鉴定出影响多能干细胞定向分化的关键调控机制和调控分子。最后研究如何操控以上关键调控因素，获得高效、安全地诱导多能干细胞分化为神经、心血管和生殖细胞的新手段，为实际应用奠定基础。二、预期目标、总体目标本项目将建立一支高学术水平的研究团队，充
6、分利用人和小鼠在体内和体外研究系统的优势和互补性，重点研究多能干细胞向三种不同模式细胞分化的以表观遗传调控为中心的分子机制。在多细胞或单细胞水平上，解析多能干细胞向三种不同模式细胞分化的、细胞特有的调控因子与表观遗传因子间相互作用的图谱，解析全基因组表达谱和表观遗传修饰谱，构建以调控因子与表观遗传因子的互作为中心的、关联表观遗传修饰和基因表达的表观遗传调控网络，找到控制不同分化方向的调控网络的共通点和特异性，全面系统地认识表观遗传调控对多能干细胞在体内、外及不同谱系分化、发育中的作用。筛选调控上述分化过程的关键调控因子（包括表观遗传因子、非编码RNA、转录因子和信号分子）；通过综合调控若干关键
7、因子来优化各分化体系，为人工操控干细胞命运，建立高效、安全的定向分化手段提供线索，为干细胞疗法的临床实现提供理论和应用基础。在相关领域取得一些理论、方法和技术突破，力争取得具有国际影响的原创性成果；培养高水平研究人才，形成能够持续进行创新性研究的能力；提升我国干细胞基础研究水平和国际影响力，促进我国干细胞和发育生物学学科的发展。、五年具体目标 （）建立人和小鼠多能干细胞 (ESCs / iPSCs)向神经外胚层、心血管中胚层和生殖细胞的分化和纯化体系。（）构建若干基因敲入（knockin) 和报告基因的小鼠模型，为研究在动物体内表观遗传机制对胚胎发育、器官形成的调控提供实验平台。（）绘制并比较
8、体内外各模式细胞的全基因组表达图谱（包括蛋白编码基因、microRNA和长链ncRNA）和表观遗传修饰图谱。（）建立关联蛋白、DNA和RNA 的三维调控网络，并解析细胞特异的调控因子（包括蛋白、长链ncRNA和microRNA）与表观遗传机制的相互作用。（）构建、整合及比较不同分化方向及状态的细胞的表观遗传调控网络，全面、动态地认识细胞命运决定和细胞谱系的特异性与稳定性维护的分子机制。（）找到影响干细胞分化和命运决定的若干关键调控因子（蛋白、microRNA或长链ncRNA)；实现向多巴胺能神经元、脊髓运动神经元、心肌、血管等组织和生殖细胞的高效定向分化。 （）预期在国际主流期刊上（影响因子I
9、F5）发表论文3050篇，力争在国际顶尖学术期刊上（包括Cell、Nature和Science等）发表论文 36篇。（）建立和培养一支具有国际影响力的高水平的干细胞研究梯队，争取培养国家杰出青年基金获得者35名，并申报专利35项。三、研究方案、总体学术思路本项目将以人和小鼠多能干细胞及小鼠体内干细胞为模型，来探讨生物发育和细胞分化的内在规律，并利用这些规律建立高效、安全的干细胞定向分化体系（如图1）。图1、总体学术思路我们将对多能干细胞分化成的三种模式细胞谱系进行研究，包括神经外胚层和心血管中胚层在内的两类体细胞以及生殖细胞。利用并优化现有的分化手段来建立分化的模式细胞系，研究和比较它们在未分
10、化及分化状态下的信号通路、转录、转录后和染色质水平上的调控，建立以表观遗传调控为中心的涉及蛋白、DNA和RNA 相互作用及转录表达的四维调控网络（通称为表观遗传调控网络）。同时，我们将建立报告基因与基因敲入、敲除的小鼠品系，通过分离体内干细胞, 从个体发育的角度深入研究以表观遗传调控为中心的调控网络如何控制动物体内的神经、心血管和生殖系统细胞的形成。比较不同分化系统和体内、外发育模型的表观遗传调控网络，找到控制多能干细胞向不同方向分化的机制的共通点和特异性。不仅要找到更多控制细胞命运的关键因子，包括转录因子、microRNA、ncRNA和表观遗传因子, 并且全面综合地认识它们如何作用于表观遗传
11、学修饰机制，影响转录表达，最终决定细胞谱系及功能。通过比较人与小鼠同类细胞分化过程中的调控机制的异同, 从进化的角度理解这一调控网络的演变。本项目的立项将为我们人工操控细胞命运提供新的线索和理论依据，并将最终促进细胞疗法的临床运用。、技术途径我们将利用最前沿的技术平台，结合现代分子生物学、生物化学、细胞生物学、遗传学、发育生物学及系统生物学方法，全面系统及深入地认识控制多能干细胞向不同方向分化的分子及表观遗传机制。依据体内组织器官发生的规律，我们将诱导多能干细胞分化为神经、心血管和生殖细胞，通过组织特异性荧光蛋白报告细胞系及表面抗原，分离纯化各分化阶段的神经、心血管和生殖细胞，初步建立一个稳定
12、的高效诱导分化方案，为研究分子机制提供细胞基础。PRC2主导的H3K27的三甲基化（H3K27me3）代表一类重要的表观遗传抑制机制。它们调控几乎所有与干细胞增殖和分化相关的发育过程，包括神经、心血管及生殖器官的形成，对ESCs的分化起不可缺少的作用。因此，我们将以PRC2为中心，研究表观遗传学调控在多能干细胞定向分化和胚胎发育中的作用。我们将用一种新的手段，利用生物素（biotin）和FLAG双标计内、外源的PRC2, 来对PRC2复合物进行蛋白质组学（tandem protein complex purification coupled with mass spec microsequen
13、cing）、基因组学 (RNA-seq、ChIP-seq和RIP-seq)、分子及细胞、生物化学的分析。我们首先利用人和小鼠ESCs的分化模型，研究PRC2在神经、心血管和生殖系统中如何与蛋白、RNA和DNA结合和相互作用。在利用体外细胞培养的同时，我们将建立基因敲入的（knock-in）小鼠品系，表达受内源启动子控制的生物素 (biotin) 和FLAG双标计的PRC2蛋白, 为研究动物体内胚胎发育、器官形成的分子机理提供实验平台。此外，利用我们在小鼠PRC2表观遗传学和microRNA系统方面的优势，我们将建立一系列转基因小鼠品系，使它们既有神经、心血管或生殖细胞特异性荧光蛋白报告体系，也
14、同时表达带标记的PRC2组分或条件性microRNA全敲除系统，研究表观遗传调控和microRNA在体内发育中的作用。对以上体外、体内不同分化模型及小鼠早期胚胎发育，利用单、多细胞microRNA和转录组分析技术（single-cell RNA-seq），全面分析多能干细胞在体内、外定向分化过程中全基因组水平的蛋白编码基因、ncRNA和microRNA的表达。利用ChIP-Seq技术分析重要表观遗传修饰谱（包括H3K27me3）。此外，我们将对几个在神经、生殖系统特异表达的RNA结合蛋白（包括Musahi、HuD、FMRP、PELOTA、DAZL和VASA等）进行RNA免疫共沉淀和高通量测序分
15、析（RIP-seq），来筛选调控神经、生殖系统分化的重要ncRNA, 阐明它们的生理功能。通过分析不同分化阶段各类细胞的mRNA、microRNA和ncRNA表达谱、PRC2靶区域和结合蛋白及ncRNA，以及表观遗传修饰谱，利用系统生物学网络构建的方法，整合以上信息，建立以表观遗传调控为中心的涉及蛋白质、DNA和RNA 相互作用及转录表达的四维表观遗传调控网络。从宏观系统水平上全面、动态地认识信号通路、转录因子、非编码RNA和表观遗传因子之间的相互作用，它们如何介导表观遗传学酶机器PRC2的募集和表观遗传标记的建立，以及这些互作对基因表达和细胞命运的影响。构建在不同分化系统和体内、外发育模型的
16、表观遗传调控网络，通过比较这些网络，认识它们的共通点和特异性，寻找影响定向分化的网络中心或节点，筛选出更多的控制细胞命运的关键因子，包括信号因子、转录因子、microRNA、ncRNA和表观遗传因子。结合过表达、RNA干扰及基因敲除等技术，研究关键因子在分化过程中的功能及它们与表观遗传机制的相互作用。包括转录因子、microRNA和ncRNA是如何控制表观遗传机制来建立特定的表观遗传状态，而表观遗传机制又是如何调控转录表达的。通过比较人和小鼠多能干细胞分化过程中转录因子、microRNA和表观遗传机制互作网络的异同, 从进化角度深入理解表观遗传为中心的调控网络在干细胞分化过程中的作用。最后，我们将把研究成果转化到人类ESCs定向分化的体系中, 优化培养条件，利用mRNA 转染、化学小分子诱导等先进技术，争取
