1、一菌种的保存重组 DNA 分子(质粒、噬菌体、粘性质粒)必须导入宿主菌中,通过细菌培养来扩增所需的重组 DNA。通常采用宿主菌是大肠杆菌,根据不同载体需求,选用不同品系大肠杆菌1. 概述:大肠杆菌其它微生物一样,都具有稳定遗传性和变异性、遗传性,保证微生物本身特征的相对稳定,即无性繁殖过程中能够保持原有的性状,为菌种保藏提供了有利因此,而变异性,使微生物的性状在繁殖过程中出现某些改变,给菌种保藏带来了困难。由于存在变异,即菌种常出现所谓的退化,主要指理想性状的丧失,从而导致发育缓慢,存活率和产质量降低等现象,菌种保藏工作就是使菌种的变异降低至最小水平,使菌种在较长期的保藏之后仍然保持着原有的生
2、命力、优良生产性能、形态特征以及不污染杂菌。能够长期在研究上应用。2. 微生物的变异速度,通常情况下,与其新陈代谢速度有关,微生物代谢活力旺盛,它的变异速度快,代谢活动微弱,变异速度就慢。并且在多次的无性繁殖过程中可能会有突变的积累。人们利用这一规律,可以创造各种条件,使微生物活动处于微弱活动或不活动状态,以减少变异的发生。3. 菌种保藏的原理是:通过低温、干燥、隔绝空气和断绝营养等手段,以达最大限度地降低菌种的代谢强度,抑制细菌的生长和繁殖。由于菌种的代谢相对静止,生命活动将处休眠状态,从而可以保藏较长时间。要求保存的菌种在复苏后除保持以前的生活与繁殖能力、不发生形态特征、生理状态及遗传性状
3、的改变外,还不允许污染任何杂菌。此外,在保存前应确保菌种的单纯性,先分离单菌落后进行鉴定,然后再繁殖保存。4. 常用的长期保存法有:液体石蜡法、硅胶保存法、加入甘油或二甲基亚砜(DMSD)等保护剂。5. 甘油低温保存法(70196)的特点i.甘油菌低温保存的基本原理是:在-70或液氮中冻存,细菌内的酶活性均己停止,即代谢处于完全停止状态,故可以长期保存。在0-70温度范围内,水晶呈针状,极易招致细菌的严重损伤。用电镜观察,可见细菌的核膜上有大量针尖样小孔。因此,为了避免0-70冰晶的形成和细菌膜两侧离子平衡的破坏,需要加保护剂。甘油可降低冰点,在缓慢的冻结条件下,能使细菌内水分在冻结前透出细菌
4、外。贮存在-70以下低温中能减少冰晶形成,甘油对细菌无毒性,分子量小,溶解度大,易穿透细菌.ii.使用浓度范围为15%-50%,一般常用30%。在保存瓶中按1:1加入60%的甘油和菌液,混匀后贮存于-70或液氮中。复苏后细菌仍能生长,活力不受任何影响。二、菌种的复苏复苏菌种时,用接种环或牙签挑取少许冻结的菌种到平皿上,37培养8-12小时即可。甘油菌从冰箱取出使用时应置于低温或 0冰浴中,用完尽快放回,接种时挑取表面已融化部分即可,不可全溶,因反复冻融会导致细胞壁破裂。切记:接种过程中不得使保存瓶中的菌液融化。三、大肠杆菌培养1.培养基配制:培养基从形态上分为液体与固体培养基。根据有无抗生素和
5、其他选择性药物分为普通与选择培养基,常用LB培养基。1)LB(Luria-Bertain)液体培养基配制精解蛋白胨(bacto-tryptone)1.0%酵母浸出粉(bacto-extract)0.5%氯化钠1.0%搅拌使之完全溶解,用5molNaOH(about0.2ml/1000ml培养基)调pH至7.0,如用进口试剂可不必调, 高压灭菌20min(120 0.1Mpa)2)含琼脂的固体培养基配制(1)普通培养基:固体培养基是在液体培养基中加 1.5%琼脂制成,先配液体培养基,然后加入 1.5%琼脂,高压灭菌20min,取出后再无菌状态下铺平板(2)选择性培养基:将消毒好的固体培养基置室温
6、下冷却50时加抗生素或其他必加成分,摇匀后倒入灭菌皿中厚度2-3mm, 室温固化。 (抗生素用三蒸水溶解后,用无菌滤头过滤到无菌瓶中, 氨苄青霉素终浓度 50l/ml)新制备的固体培养基较湿,铺上的液体不易吸收,可在室温下放 2-3天,或37放半小时,然后4保存备用。(3)LB培养基中所用抗生素终浓度:氨苄青霉素-50l/ml;氯霉素-20l/ml;庆大霉素-15l/ml;卡那霉素-30l/ml;春日霉素-1000l/ml;壮观霉素-100l/ml;链霉素-30l/ml;四环素-12l/ml。注意:除了四环素保存-20,其余均应保存4,所有抗生素均应溶于无菌去离子水。四环素对光敏感2.液体细菌
7、培养1)小量培养:(1) 取灭菌 16 或 18mm 口径培养管,加 3-5mlLB 培养基,再加 50mg/ml 氨苄青霉素 3-5ul(宿主菌不加抗生素)(2) 无菌牙签挑取单菌落,送入培养液中,或取菌液 5-10ul,转入培养液中,封好管口(3) 37摇床培养 100-200r/min 至生长饱和,约 6-12 小时2)大量培养:取 500ml 培养瓶内装培养基 100-200ml,及相应抗生素。以 0.5-1%浓度接种菌液,37 度摇床培养100-200r/min至OD值0.6-0.8。3.固体细菌培养: 用于单一菌落的挑选,转化后抗性菌落的筛选。方法:采用划痕接种法。用接种环从菌种中沾取少量菌液,划线。