1、底物浓度对反硝化MBBR处理反渗透浓水脱氮效能及脱氮基因的影响 ：针对污水处理厂生产高品质再生水过程中低压反渗透单元(DFRO)产生的反渗透浓水中TN浓度高和NOxOx-N(NO3O3-N+NO2O2-N)占比高的问题,采用反硝化MBBR处理实际反渗透浓水,研究不同底物浓度下反硝化MBBR的脱氮效能和反硝化基因拷贝数的变化。结果说明:进水NO3O3-N浓度为(8.706.34)(24.238.69)mg/L,TN浓度为(28.435.69)(44.107.37)mg/L时,随着浓度的升高NO3O3-N和TN去除率保持平稳,但NO3O3-N和TN去除速率上升,NO2O2-N去除率和去除速率下降。
2、进水NO2O2-N浓度为(10.948.51)(20.945.78)mg/L时,随着浓度的升高,NO3O3-N和TN去除率及去除速率降低,NO2O2-N去除率及去除速率上升。反硝化MBBR填料生物膜主要由球菌、杆菌和少量丝状菌组成;填料生物膜和底泥中各脱氮基因拷贝数随NO3O3-N和TN浓度增加而增大,nirK、nirS和Anammox等基因拷贝数也随NO2O2-N浓度增加而增大。关键词：反渗透浓水;反硝化MBBR;底物浓度;脱氮基因;NO2O2-N积累MBBR(moving bed biofilm reactor)是在反响器中填充密度接近于水的填料,利用填料上的生物膜和活性污泥同时去除污水中
3、污染物的微生物处理工艺,具有高效灵活、耐冲击负荷、剩余污泥少和脱氮除磷效率高等优点1。近年来,反硝化MBBR被用于生活污水和海水中氮的深度去除2,3,4。反硝化MBBR用于处理被NO3O3-N污染的海水时,反硝化速率达(17.71.4)g/(m2d)3;用于处理生活污水时,TN去除率可达94%5。前置和后置反硝化MBBR在用于污水处理厂的深度处理时,TN去除率可达90%2。苑泉等6在进水TN浓度为9.7 mg/L时,用反硝化MBBR处理二沉池出水,TN去除率到达50%。反硝化MBBR运行过程中会受到包括底物浓度、温度、碳氮比、水力停留时间(HRT)和填料类型等因素的影响,进水中氮负荷的变化会影
4、响反硝化脱氮效能和反硝化微生物群落结构7。在对垃圾渗滤液进行反硝化和厌氧氨氧化协同脱氮时,当TN负荷由15 g/(m3d)增至25 g/(m3d)时,TN去除率由67.7%降至60.2%8;而在水体中TN浓度为1.216.50 mg/L时,反硝化细菌群落结构也会发生相应变化9。上述研究均说明,进水底物浓度会影响生物的脱氮效能和微生物群落结构。在全世界水资源匮乏日渐严重的形势下,反渗透技术(reverse osmosis,RO)因具有处理效率高、能源消耗低和占地面积小等优点10逐渐被用于城市污水处理厂尾水的处理和生产高品质水工艺中。但RO在生产高品质回用水的同时也会产生反渗透浓水,氮等物质会在反
5、渗透浓水中富集。低压反渗透单元(DFRO)被用于城市污水厂出水生产高品质再生水,在该过程中DFRO产生的反渗透浓水具有TN浓度高和NOxOx-N(NO3O3-N +NO2O2-N)占比高等特点11,亟需对NO2O2-N、NO3O3-N和TN进行深度去除。目前国内外应用反硝化MBBR处理的污水有城镇污水、污水处理厂尾水和海水等12,鲜见将其用于处理高品质再生水过程中产生的反渗透浓水的研究。针对反渗透浓水TN浓度高和NOxOx-N占比高的问题,笔者采用反硝化MBBR处理实际反渗透浓水,研究底物浓度对其脱氮效能及脱氮相关基因的影响,考察不同底物浓度下反硝化MBBR对NO2O2-N、NO3O3-N和T
6、N的去除效能,揭示反硝化基因等脱氮基因对不同底物浓度下反硝化MBBR脱氮效能的响应。1 材料与方法1.1 试验装置反硝化MBBR装置采用有机玻璃制成。反响器为圆柱型,内径0.25 m,高0.25 m,有效体积为12 L(图1)。其中填充本课题组研发的液相氧化-水浴接枝丙烯酸改性聚乙烯填料13,填料性能参数见表1。1.2 试验设计取北京某污水处理厂缺氧池中的污泥接种,接种后反响器内污泥混合液悬浮固体(MLSS)浓度为3 544 mg/L,混合液挥发性固体(MLVSS)浓度为1 897 mg/L,MLVSS/MLSS为0.54。采用连续流进水方式,根据实际反渗透浓水进水中NO3O3-N、NO2O2
7、-N和TN的浓度变化特征,分4个阶段(、和)研究底物浓度对MBBR反硝化效能的影响。用加热棒控制温度为2427 ,HRT为12 h,填料填充率为30%,采用电动搅拌器搅拌使填料和污泥保持悬浮状态。适当补充甲醇作为外加碳源,使进水COD/TIN为2.94.8,反响器中溶解氧浓度低于0.5 mg/L。各阶段进水水质见表2。1.3 水质分析方法测定的水质指标、分析方法和所用仪器如表3所示。每4 d取样1次,水样经0.45 m滤膜过滤后测定NH+4H4+-N、NO2O2-N和NO3O3-N浓度,静置后取上清液测定其他指标。试验中所用药品均为分析纯(国药集团化学试剂北京)。1.4 微生物及分子生物学分析
8、在每个阶段稳定期,取适量填料和底泥进行生物量、扫描电镜(SEM)及荧光定量PCR(qPCR)测定。生物量测定:取一定量各阶段稳定期的反硝化MBBR填料浸于1 mol/L的NaOH溶液中,经80 水浴30 min后,100 W超声1 min,涡旋振荡30 s,测定溶液中SS浓度6。SEM观察15:取各阶段稳定期反硝化MBBR填料,用无菌剪剪至5 mm5 mm的小块,用2.5%中性戊二醛固定,磷酸缓冲液清洗,乙醇梯度脱水,进行临界点枯燥和喷金后,置于SEM电镜下观察。qPCR测定:在ABI 7500型荧光定量PCR仪(Life Technologies,美国)对各阶段稳定期的填料生物膜和底泥样品进
9、行qPCR分析,对16S rRNA基因、厌氧氨氧化细菌基因(Anammox)和反硝化中编码硝酸盐复原酶功能基因(narG)、编码cytoome cd1亚硝酸盐复原酶基因(nirK)、编码copper亚硝酸盐复原酶基因(nirS)和编码N2O复原酶基因(nosZ)的拷贝数进行定量分析,各目的基因的引物序列见表4。用土壤基因组DNA提取试剂盒(MP Biomedicals,美国)提取生物膜和底泥样品的DNA。20 L的qPCR混合反响物由16.4 L的2X Taq Plus Master Mix(Vazyme Biotech,美国),2 L的模板DNA,0.8 L的正向引物和0.8 L的反向引物组
10、成。qPCR的反响条件:95 预变性5 min;在不同温度下(16S rRNA基因、narG和nirS,60 ;nirK,54 ;nosZ,56 ;Anammox,55 )变性30 s,共40个循环;最后72 延伸40 s。每个样品设3个平行样。用Nano Drop 2022 分析仪(Thermo Fisher Scientific, 美国)监测构建质粒的数量与质量。以10倍梯度稀释反硝化细菌及各功能基因重组质粒进行qPCR(博日9600Plus,中国)检测,获得16S rRNA基因、Anammox及各功能基因标准曲线。R2为0.994 90.999 9,扩增效率为84.8%99.7%。2 结
11、果与讨论2.1 底物浓度对反硝化MBBR脱氮效能的影响2.1.1 底物浓度对去除NO3O3-N的影响2.1.1.1 进水TN和NO3O3-N浓度由表2可知,阶段相对于阶段,进水NO2O2-N和NH+4H4+-N浓度根本未变。由图2(a)可见,进水NO3O3-N和TN浓度分别由(8.706.34)和(28.435.69)mg/L增至(24.238.69)和(44.107.37)mg/L时,NO3O3-N去除率分别为83.9%4.01%和80.69%7.46%;反硝化速率由(15.483.80)g/(m3d)增至(44.583.67)g/(m3d)。可见反响器内微生物对NO3O3-N和TN浓度增加
12、适应良好,对NO3O3-N去除率影响不大,反硝化率随浓度增加而增加。在生物活性炭硫反硝化脱氮系统中,当进水NO3O3-N浓度为1040 mg/L时,NO3O3-N去除率根本未变化22,与本研究结果一致,但其NO3O3-N去除率在93%以上,高于本研究,可能与反渗透浓水水质复杂有关。用土壤基因组DNA提取试剂盒(MP Biomedicals,美国)提取生物膜和底泥样品的DNA。20 L的qPCR混合反响物由16.4 L的2X Taq Plus Master Mix(Vazyme Biotech,美国),2 L的模板DNA,0.8 L的正向引物和0.8 L的反向引物组成。qPCR的反响条件:95
13、预变性5 min;在不同温度下(16S rRNA基因、narG和nirS,60 ;nirK,54 ;nosZ,56 ;Anammox,55 )变性30 s,共40个循环;最后72 延伸40 s。每个样品设3个平行样。用Nano Drop 2022 分析仪(Thermo Fisher Scientific, 美国)监测构建质粒的数量与质量。以10倍梯度稀释反硝化细菌及各功能基因重组质粒进行qPCR(博日9600Plus,中国)检测,获得16S rRNA基因、Anammox及各功能基因标准曲线。R2为0.994 90.999 9,扩增效率为84.8%99.7%。2.1.1.2 进水NO2O2-N浓
14、度由表2可知,阶段相对于阶段,进水TN浓度根本未变,但由图2(b)可见,NO3O3-N浓度减少6.20 mg/L,NO2O2-N浓度增加10.00 mg/L;阶段相对于阶段,进水TN浓度根本未变,NO3O3-N浓度减少5.62 mg/L,NO2O2-N浓度增加6.45 mg/L。由2.1.1.1节可知,进水NO3O3-N浓度对NO3O3-N去除率影响不大,因此只考虑NO2O2-N浓度对NO3O3-N去除的影响。阶段相对于阶段,NO3O3-N去除率降低5.86个百分点,反硝化速率降低12.19 g/(m3d);阶段相对于阶段,NO3O3-N去除率降低4.52个百分点,反硝化速率降低8.21 g/
15、( m3d)。由以上分析可知,随着NO2O2-N浓度的增加,NO3O3-N去除率和反硝化速率均下降。王少坡等23报道在进水(NO3O3-N+ NO2O2-N)浓度一定时,NO2O2-N占比越高,反硝化结束时反响器内pH越高;而反响器内pH升高可能会超出反硝化最适pH,从而降低NO3O3-N去除率和反硝化速率24。王亚宜等25研究发现,当NO2O2-N浓度由5.5 mg/L增至15.0 mg/L时,序批式活性污泥反响器反硝化速率降低。2.1.2 底物浓度对去除NO2O2-N的影响2.1.2.1 进水TN和NO3O3-N浓度由图3可见,阶段于相对于阶段,NO2O2-N去除率由86.55%3.73%降至76.46%6.69%;同时NO2O2-N去除速率也由(42.665.46)g/(m3d)降至(31.812.66)g/(m3d)。可见随着TN和NO3O3-N浓度增加,NO2O2-N去除率和去除速率均下降。可能是因为在反硝化过程中,每消耗1 g NO3O3-N或NO2O2-N产生3.57 g碱度(以CaCO3计),反硝化过程可导致反响器内pH升到9以上,且进水NO3O3-N浓度越高,产生的碱度越高26。有报道指出,当pH
