1、灰绿黄堇总生物碱对实验性溃疡性结肠炎的作用研究:灰绿【】 目的 研究灰绿黄堇总生物碱(ACAM)对小鼠结肠炎的作用及其机制。方法 实验设正常、模型、柳氮磺胺吡啶组(SASP，520 mg/kg)和ACAM组(100、200、400 mg/kg)。正常组小鼠饮用蒸馏水，其余组自由饮用4%葡聚糖硫酸钠(DSS)水溶液，同时分别灌胃给予溶剂或干预药物(02 ml/10 g,1次/d7 d)。记录小鼠疾病活动指数(DAI)；测定结肠组织MDA含量，SOD、MPO活性及ICAM-1、NF-B p65表达水平。结果 模型组DAI显著增高，结肠黏膜损伤严重；MDA舍量、MPO活性及ICAM-1和NF-B p
2、65表达明显升高。SOD活性下降(P1。它是一种具有较好的消炎、利胆、排石、止痛作用的草药2。王继生等3对其灰绿黄堇的水提物进行研究，发现灰绿黄堇的水提取物具有明显的镇痛、抗炎作用。作者对灰绿黄堇水提物镇痛抗炎的有效部位进行筛选，发现灰绿黄堇水提物镇痛抗炎的有效部位为灰绿黄堇总生物碱(the crude alkaloids of corydalis adunca maxim,ACAM)4，同时发现灰绿黄堇总生物碱对实验性溃疡性结肠炎有很好疗效，本实验采用小鼠实验性溃疡性结肠炎模型观察ACAM的药效学及其作用机制，现报道如下。 1 材料与方法 11 材料 清洁级BALB/c小鼠，雌雄兼用，体质量
3、(202)g，由重庆医科大学实验动物中心提供；ACAM由重庆医科大学化学教研室提供(纯度大于95%)。DSS由Sigma公司(美国)提供；SASP由浙江九州药业股份提供；SOD、MDA、MPO检测试剂盒购于南京建成生物研究所；ICAM-1、NF-kB p65一抗均购自美国Santa Cruz公司；SP试剂盒由北京中山生物技术提供。 12 方法 参照Cooper等5的方法建立小鼠溃疡性结肠炎模型:将DSS溶于蒸馏水，配成4%DSS溶液，让BALB/c小鼠自由饮用7 d。实验设正常对照组、模型组、SASP组(520 mg/kg)、和ACAM组(50、100、200 mg/kg)。正常对照组小鼠饮用
4、蒸饮水，造模组自由饮用蒸饮水配制的4%DSS溶液；同时灌胃给予干预药物或溶剂对照(02 ml/10 g，1次/d7 d)。其间，每天称量体质量，采用联苯胺法检测大便稳血，观察粪便性状；以体质量下降百分比、隐血试验及大便性状评分之和除以3作为DAI3(见表1)。第8天处死小鼠，取下整段结肠，用冰冷生理盐水冲洗干净。结肠组织分两局部:一局部快速放入氮中速冻，转入-70低湿冰箱保存，用于检测SOD、MDA、MPO，检测操作按相应试剂盒说明进行；另取远端结肠约1 cm的组织块放入4%甲醛溶液中固定、切片、HE染色，检测ICAM-1、NF-B p65表达。免疫组化检测步骤严格按相应试剂盒说明进行，均以非
5、免疫性山羊血清封闭非特异性抗原，一抗分别为1:200的ICAM-1与NF-B p65；二抗均为生物素化头号抗免IgG 工作液，以PBS缓冲液代替一抗做阴性对照；ICAM-1以细胞膜呈橙黄色为阳性，NF-kBp 65以胞膜或胞核呈橙黄色为阳性。每张切片选取10个X400视野，采用GD-8型病理影像多媒体分析系统，测定面积积分光密度作为ICAM-1、NF-B p65表达含量。 13 统计学方法 所有用SPSS120统计软件处理，计量资料数据用xs表示，采用单因素方差分析和非参数Wilcox on秩和检验，比拟各组资料间的差异，以P4认为，DSS通过对结肠上皮细胞的直接毒性作用以及激活炎性细胞，释放
6、炎性介质和细胞因子，后者诱发非特异性免疫反响，导致结肠黏膜损伤。临床检验证实，中性粒细胞活化、浸润是UC活动期的突出特点；MPO是存在于中性粒细胞，被认作是量化炎性反响的一项重要指标5。中性粒细胞呼吸爆发，产生大量氧自由基，诱发脂质过氧化，引起蛋白质变性和交联，细胞膜结构受损。SOD是存在于生物体内的重要的抗氧化酶系，能有效地去除氧自由基，从而抑制肠组织中的脂质过氧化损伤；MDA为脂质过氧化的终末产物，其含量反映了组织中过氧化损伤程度。本实验显示，SASP和ACAM能明显抑制DSS诱导小鼠结肠组织MPO活性和MDA含量升高，阻遏SOD活性下降，提示ACAM可能抑制中性粒细胞浸润，减轻机体抗氧系
7、统破坏，促进氧自由基的去除。中性粒细胞和其他炎性细胞释放大量炎症介质(白细胞三烯、前列腺素等)4用DSS诱导严生最新合免疫缺陷小鼠(缺乏T和B淋巴细胞)，同样能诱导出严重的结肠炎性反响，提示特异性免疫反响在形成实验性结肠炎的初始阶段中不起决定性作用；鉴于UC患者及DSS结肠黏膜固有层中有淋巴细胞、浆细胞浸润，提示特异性免疫应答(细胞免疫和体液免疫)可能参与了UC病程的开展。因此，ACAM抑制中性粒细胞浸润和抗氧化只是其发挥抗EUC作用的一个方面。 黏附分子是一类跨膜蛋白，能介导细胞黏附、趋化和淋巴细胞归巢等，参与机体的炎性反响和免疫反响。目前已证实细胞黏附分子与UC炎症反响关系密切，多种黏附分
8、子在UC患者结织和血细胞中表达增强。Wong等7对乙酸诱发的IBD小鼠给予抗ICAM-1抗体，结果显示小鼠肠上皮细胞破坏程度减轻，白细胞浸润浸少，髓过氧化物酶活性降低2倍，超氧化物减少将近85%，提示ICAM-1在UC发病有密切关系6。ICAM-1和VCAM-1基因启动子上均含有NF-B结合位点，各种刺激信号使胞质中未活化的NF-B激活并进入胞核，后者与NF-B位点结合即能启动相关基因转录，促使细胞黏附分子的表达；细胞黏附分子反过来进一步活化NF-B，形成一个正反响调节，使炎症级联放大8-9。本研究显示，SASP和ACAM能明显抑ICAM-1表达和NF-B激活，且ICAM-1表达与NF-B的活
9、化程度之间存在一定的相关性。因此，有理由认为ACAM与SASP可能存在相似的作用机制，但ACAM的具体作用机制尚需进一步报道。 参考文献 1 张莉，刘玮.灰绿黄堇的鉴别.基层中药杂志， 2002，16(4):39-40. 2 杨永昌藏药志西宁:青海入民出版社，1991:358. 3 王继生，张莉，邱宗荫，等.灰绿黄堇镇痛抗炎作用的实验研究.中药药理与临床， 2022，21(5):33-34. 4 王继生，张莉，邱宗荫，等.灰绿黄堇总生物碱镇痛抗炎作用的实验研究.中国药房， 2022，19(7):468-470. 5 Krawisz JE,Sharon P,Stenson WF,et al.Qu
10、antitative assay for acute intestinal inflammation based on myeloperoxidase activity.Assessment of inflmmaiton in tat and hamster mod-els.Gastroenterology,1984,87(6):1344. 6 Neurath NF.Pathogenesis of inflammotory bowel disease:tran- scripinon factors in the spotilight.Guit,1998,42(4):458. 7 Wong PY
11、,Yue G,Yin K,et al.Antibodies to intercellular adhesion molecule-l ameliorate the inflammatory response in acetic acid-induced inflammatory bowel disease.J Phar-macol Exp Ther,1995，274(1):475. 8 Minami T,Abid MR,Zhang J,et al.Thrombin stimulation of vascular adhgesion molecule-l in endothelial cells
12、 is mediater by protein kinase C(PKC)-delta-NF-kappa B and PKC-zeta-GATA signaling pathways.J Biopl Chem,2003,278(9):69-76. 9 Tamanini A,Rolfini R,Nicolis E,et al.MAP kinases and Nf- kappaB collaborate to induce ICAM-l geneexpressinon in the early phase of adenovirus infection.Virology,2003,307(2):228.
