1、PI可以用来进行活细胞、死细胞的双重染色钙黄绿素-AM(Calcein-AM)和碘化丙啶(PI)溶液,它们分别可对活细胞和死细胞染色。Calcein-AM的乙酸甲基酯亲脂性很高,使其可透过细胞膜。尽管Calcein-AM本身并不是荧光分子,但通过活细胞内的酯酶作用,Calcein-AM能脱去AM基,产生的Calcein能发出强绿色荧光(激发:490nm,发射:515nm)。因此Calcein-AM仅对活细胞染色。另一方面,作为核染色染料的PI不能穿过活细胞的细胞膜。它穿过死细胞膜的无序区域而到达细胞核,并嵌入细胞的DNA双螺旋从而产生红色荧光(激发:535nm,发射:617nm)。由于Calc
2、ein和PI-DNA都可被490nm激发,因此可用荧光显微镜同时观察活细胞和死细胞。用545nm激发,仅可观察到死细胞。由于不同细胞系的最佳染色条件不同,我们建议个别确定PI和Calcein-AM的合适浓度。I试剂Calcein-AMPIII用荧光显微镜观察细胞形态以HeLa细胞染色为例,请注意不同的细胞种类、不同浓度有不同的观察条件。根据细胞条件,摸索不同条件下的细胞贴壁情况和试剂浓度的配制等最佳条件。染色溶液的配制1)用1ml无水DMSO溶解1mgCalcein-AM,制备成1mmol/l的Calcein-AM储备液,-20下密闭冷冻保存。2)用1mlddH2O溶解1mgPI,制备成1.5
3、mmol/l的PI储备液(1mgPI/1mlH2O),-20下密闭冷冻保存。3)将Calcein-AM储备液和PI储备液放置于室温。4)加10lCalcein-AM储备液和15lPI储备液至5mlPBS中配制成染色溶液。Calcein-AM的终浓度为2moll,PI的终浓度为4moll。2细胞染色1)染色HeLa细胞等贴壁细胞时,先用Trypsin-EDTA等消化细胞,制备成细胞悬液。2)将细胞悬液离心3分钟(1,000rpm)。3)去除上清液,加入PBS缓冲液,细胞数量调整至105106个ml。再用移液器充分混匀。4)由于培养基中的血清等含有酯酶,Calcein-AM遇水会分解,会导致空白上
4、升,所以需要离心数次,用PBS洗涤数次直到完全洗净。5)将200l细胞悬液移至小试管中,加入100l染色溶液,在37下孵育15分钟。6)在盖玻片上滴加适量的染色的细胞溶液。7)在荧光显微镜下,先使用49010nm波长激发,观察黄绿色的活细胞,还可以同时观察到红色的死细胞,然后用545nm波长激发,能够看到红色的死细胞。*在荧光显微镜下观察时,如果背景高,可以用培养基清洗掉细胞外的染料后再观察。*Calcein-AM溶液和PI溶液可以混合在一起染色,也可以分开进行染色,加入的先后顺序没有影响。3染色试剂的最佳浓度Calcein-AM和PI的最适浓度是根据不同的细胞种类而定,通过以下的操作,我们可以找到不同细胞染色试剂的最佳浓度。1)通过在0.1%皂苷或0.1-0.5%毛地黄皂苷中孵育10分钟或通过在70%乙醇中孵育30分钟制备死细胞。2)用0.1-10M的PI溶液对死细胞染色,以便找到仅对细胞核染色而不对细胞质染色的PI浓度。3)用0.1-10M的Calcein-AM溶液对死细胞染色,以便找到不对细胞质染色的Calcein-AM浓度。接着用该浓度的Calcein-AM对活细胞染色以检验活细胞可否被染色。