1、附件1结核分枝杆菌特异性细胞免疫反应检测试剂技术审查指导原则（征求意见稿）一、前言本指导原则旨在指导注册申请人对结核分枝杆菌特异性细胞免疫反应检测试剂注册申报资料的准备及撰写，同时也为技术审评部门对注册申报资料的技术审评提供参考。本指导原则是对结核分枝杆菌特异性细胞免疫反应检测试剂的一般要求，申请人应依据产品的具体特性确定其中内容是否适用，若不适用，需具体阐述理由及相应的科学依据，并依据产品的具体特性对注册申报资料的内容进行充实和细化。本指导原则是对申请人和审查人员的指导性文件，但不包括注册审批所涉及的行政事项，也不作为法规强制执行，如果有能够满足相关法规要求的其他方法，也可以采用，但需要提供
2、详细的研究资料和验证资料，相关人员应在遵循相关法规的前提下使用本指导原则。本指导原则是在现行法规和标准体系以及当前认知水平下制定的，随着法规和标准的不断完善，以及科学技术的不断发展，本指导原则相关内容也将适时进行调整。二、范围结核分枝杆菌特异性细胞免疫反应（即-干扰素释放试验，IGRAs）的主要原理：受到结核分枝杆菌抗原刺激致敏的T细胞再次遇到相同抗原时，可产生-干扰素，IGRAs通过检测全血或者分离自全血的单核细胞（PBMC）在结核分枝杆菌特异性抗原刺激下产生的-干扰素，判断受试者是否存在结核分枝杆菌感染。目前，国际上较成熟的IGRAs有2种：（1）采用酶联免疫吸附实验（ELISA）方法检测
3、全血中致敏T细胞再次受到结核分枝杆菌特异性抗原刺激后释放的-干扰素水平；（2）采用酶联免疫斑点技术（ELISPOT）方法测定在结核分枝杆菌特异性抗原刺激下，外周血单核细胞中能够释放-干扰素的效应T细胞数量。上述两种检测方法的原理类似，检测技术和操作程序略有不同，采用的结核分枝杆菌特异性刺激抗原主要存在于结核分枝杆菌复合群中，在卡介苗和大多数非结核分枝杆菌中缺失。结核分枝杆菌特异性细胞免疫反应检测试剂是指：利用免疫学检测技术，如ELISA或ELISPOT技术等，以结核分枝杆菌特异抗原刺激T细胞产生的-干扰素为检测靶标，对人静脉全血中的结核分枝杆菌特异性细胞免疫反应进行体外检测的试剂，用于结核分枝
4、杆菌感染的辅助诊断或用于结核病的辅助诊断。本指导原则的技术要求是基于ELISA和ELISPOT方法建立的，对于其他免疫学方法，可能部分要求不完全适用或本文所述技术指标不够全面，申请人可以根据产品特性对不适用部分进行修订或补充其他的评价和验证，但需阐述不适用的理由，并验证替代方法的科学合理性。本指导原则适用于进行首次注册申报和相关许可事项变更的产品。三、注册申报资料要求（一）综述资料综述资料主要包括产品预期用途、产品描述、有关生物安全性的说明、研究结果的总结评价以及国内外同类产品上市情况介绍等内容。其中，同类产品上市情况介绍部分应着重从预期用途、方法学、检验原理、结核分枝杆菌特异性刺激抗原以及最
5、低检出限等方面写明申报试剂与目前市场上已获批准的同类产品之间的主要区别。若结核分枝杆菌特异性刺激抗原为新抗原，则应详细论述其能提高该类试剂灵敏度和特异性的科学依据，并提供充分的支持资料。综述资料应符合体外诊断试剂注册管理办法（国家食品药品监督管理总局令第5号，以下简称办法）和关于公布体外诊断试剂注册申报资料要求和批准证明文件格式的公告（国家食品药品监督管理总局公告2014年第44号）的相关要求。（二）主要原材料的研究资料应提供主要原材料如抗原肽/重组抗原、抗体、阴性对照、阳性对照、标准品（-干扰素）、酶、以及企业参考品等的选择与来源、制备过程、质量分析和质量控制标准等的研究资料。若主要原材料为
6、企业自己生产，其生产工艺必须相对稳定；如主要原材料购自其他供货商，应提供的资料包括：供货商提供的质量标准、出厂检定报告或性能指标证书，以及该原材料到货后的质量检验资料。企业参考品：申请人应提供企业参考品的详细的来源、制备和确定等资料。对于采用ELISPOT方法的申报试剂，企业参考品至少应包括：阴性参考品、阳性参考品和重复性参考品。其中，阳性参考品建议采用结核病患者（菌阴和菌阳）的全血，阴性参考品建议采用随机健康人群和非结核病患者的全血，重复性参考品建议采用结核病患者的全血。鉴于冻存循环会损害全血样本中细胞的免疫功能，不建议采用冻存的全血作为企业参考品。对于采用ELISA方法的申报试剂，企业参考
7、品至少应包括：阴性参考品、阳性参考品、最低检测限参考品、线性参考品、准确度参考品和精密度参考品等。其中，阴性参考品、阳性参考品和精密度参考品的设置可参考采用ELISPOT方法的申报试剂的相关要求；最低检测限参考品、准确度和线性范围参考品，主要考察ELISA部分的性能，可采用含有-干扰素的溶液（建议采用血浆作为基质溶液）。对于阴性/阳性对照：申报试剂的质控体系通过设置阳性、阴性对照来实现，申报资料应详细描述各种对照的原料选择、制备、定值过程等试验资料。本指导原则的技术要求是基于ELISA和ELISPOT方法建立的，对于采用上述方法学的结核细胞类检测试剂，建议至少设置阳性对照和阴性对照。阳性对照一
8、般采用单核细胞非特异性刺激物，用于质控外周血单核细胞功能是否正常，避免产生假阴性。阴性对照一般为检测过程所用培养基，用于控制细胞在活化过程中所产生的各种因子的非特异性影响，避免产生假阳性。校准品（如适用）的选择及质量标准：应详细描述校准品的来源、制备、纯度、浓度、分子量、功能活性等的确定和验证资料。多肽/重组抗原的选择及质量标准：应详细描述多肽的来源（来自何种抗原）/重组抗原的来源、组成、分子量、纯度、浓度、内毒素含量、刺激活性、特异性等的确定和验证资料。如为冻干抗原，还应设置水分含量的质控标准。抗体的选择及质量标准：应详细描述抗体的来源、纯度、浓度、分子量、免疫原性、效价和功能活性等的确定和
9、验证资料。（三）主要生产工艺及反应体系的研究资料主要生产工艺包括：配制工作液、分装和包装等，可用流程图表示。应提供主要生产工艺的确定依据，包括试验方法和数据等。反应体系研究资料应能对产品说明书中检验方法部分涉及到的基本内容，如样本用量、试剂用量、反应条件等，提供确定的依据，包括试验方法和数据等。（四）分析性能评估资料企业应提交对申报试剂进行的所有性能验证的研究资料，包括具体的试验方法、内控标准、实验数据和统计分析等。对于结核分枝杆菌细胞免疫反应检测试剂，建议着重对以下分析性能进行研究。1、对于采用ELISA方法的申报试剂检验方法分为两大部分：（1）将结核分枝杆菌特异性抗原与全血样本共培养，获得
10、含有-干扰素的血浆样本；（2）以-干扰素标准品做校准曲线，对第（1）步的血浆样本采用ELISA方法进行定量检测。基于该方法学的分析性能，需要对上述两方面的性能均进行验证。1.1最低检测限建议采用含有系列-干扰素稀释浓度的血浆样本，对每个浓度样本进行多次重复检测，选取（测定平均OD值-2SD）大于（0浓度测定的平均OD值+2SD）的浓度作为最低检测限浓度。申请人也可采用其他合理方法确定申报试剂的最低检测限。1.2线性范围线性范围确定的研究应使用高值样本（采用血浆基质，采用可溯源至国际校准品的方法对血浆样本中的-干扰素进行定量）进行梯度稀释，稀释液应使用血浆，应包含接近最低检测限的临界值浓度。通过
11、评价一定范围内的线性关系确定申报试剂的线性范围。1.3 准确度可采用如下方法进行评价，如：与国际标准品的偏差分析、回收试验或方法学比对等方法，企业可根据实际情况选择合理方法进行研究。1.4 分析特异性1.4.1交叉反应交叉反应的验证主要考虑全血自身含有的细胞因子或全血刺激培养过程中产生的细胞因子与申报试剂所用-干扰素抗体对是否存在交叉反应。需要进行交叉反应验证的细胞因子包括：IL-1、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-12、IL-10、TNF、IFN-和IFN-等。建议在0浓度-干扰素水平和最低检测限浓度-干扰素水平分别进行交叉反应的验证。同时，建议申请人采用一
12、定数量的其他常见分枝杆菌感染患者的全血样本进行试验，评价申报试剂的特异性。1.4.2干扰物质应对全血样本中常见的干扰物质进行验证，包括：抗凝剂、甘油三酯、血红蛋白、胆红素、类风湿因子、抗核抗体、抗线粒体抗体和免疫抑制剂等。建议采用含有不同浓度-干扰素的血浆样本分别进行干扰物质的验证，给出不产生干扰的最高干扰物浓度。1.5精密度1.5.1采用全血样本进行试验的精密度：分别采用阳性全血样本和阴性全血样本，进行多次重复检测，判断检测结果的阴阳性，多次重复检测结果应一致。1.5.2采用含有-干扰素的血浆样本进行试验的精密度：建议在-干扰素0浓度、低浓度和中等浓度3个浓度水平分别进行验证。1.5.2.1
13、阴性样本（0浓度）：不含-干扰素的样本，CV15%（n20）。1.5.2.2低浓度样本：-干扰素浓度略高于试剂盒的最低检测限，CV15%（n20）。1.5.2.3中等浓度样本：采用中等浓度的样本进行重复检测，CV15%（n20）。1.5.3 申请人应设置合理的精密度评价周期，以便对批内/批间、日内/日间以及不同操作者之间的精密度进行综合评价。1.6 阴性参考品符合率建议选择至少15份健康人和非结核病患者的全血样本进行试验，阴性参考品符合率不低于75%。1.7 阳性参考品符合率建议选择至少20份结核病患者（至少10例细菌学阳性，至少10例细菌学阴性）全血样本进行试验，阳性参考品符合率不低于80%
14、。1.8 校准品的溯源资料-干扰素具有国际标准品，建议检测结果的量值溯源至国际标准品。申请人应提供从国际标准品到产品标准品的溯源链以及各级赋值资料。2、对于采用ELISPOT方法的申报试剂检验方法为：将结核分枝杆菌特异性抗原与分离的单核细胞（PBMC）共培养，活化刺激PBMC分泌的-干扰素被微孔板上包被的单克隆抗体捕获，再用酶标记的另一个单克隆抗体进行反应显色，一个斑点即代表一个细胞，计数斑点的多少，从而判断是否存在结核分枝杆菌特异性的细胞免疫反应。基于该方法学的分析性能，需从下述几个方面进行性能验证。2.1 分析特异性2.1.1交叉反应交叉反应的验证主要考虑PBMC刺激培养过程中产生的细胞因
15、子与申报试剂所用-干扰素抗体对是否存在交叉反应。需要进行交叉反应验证的细胞因子包括：IL-1、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-12、IL-10、TNF、IFN-和IFN-等。建议在0浓度-干扰素水平和低浓度-干扰素水平分别进行交叉反应的验证。同时，建议申请人采用一定数量的其他常见分枝杆菌感染患者的全血样本进行试验，评价申报试剂的特异性。2.1.2干扰物质应对全血样本中常见的干扰物质进行验证，包括：抗凝剂、甘油三酯、血红蛋白、胆红素、类风湿因子、抗核抗体、抗线粒体抗体和免疫抑制剂等。建议采用全血样本进行干扰物质的验证，给出不产生干扰的最高干扰物浓度。2.2精密度
16、采用全血样本（包括高斑点数样本、中等斑点数样本和cut-off值附近斑点数样本）分别进行精密度评价，进行多次重复试验，判断检测结果的阴阳性，多次重复检测结果应一致。同时，还应计数斑点数，计算其CV值。cut-off值附近斑点数样本的CV值差异可能最大，但也不能超过25%。申请人应设置合理的精密度评价周期，以便对批内/批间、日内/日间以及不同操作者之间的精密度进行综合评价。2.3 阴性参考品符合率建议选择至少15份健康人和非结核患者的全血样本进行试验，阴性参考品符合率不低于75%。2.4 阳性参考品符合率建议选择至少20份结核病患者（10例细菌学阳性，10例细菌学阴性）全血样本进行试验，阳性参考品符合率不
