1、BCA法测定蛋白浓度-酶标仪一、药品1. BCA蛋白浓度测定试剂盒（P0012，500次酶标仪，碧云天），含以下成分：a) BCA试剂A（P0012-1，100ml，碧云天），室温保存b) BCA试剂B（P0012-2，3ml，碧云天），室温保存c) 蛋白标准（5mg/ml BSA）（P0012-3，1ml，碧云天），-20度保存二、仪器和试剂1. 酶标仪（测定波长为540-595nm之间，562nm最佳），水浴锅2. 96孔单条可拆酶标板（平底）3. 15 ml 离心管1个（准备BCA工作液用） 4. 1.5 ml 离心管1个（准备蛋白标准品工作液用）5. 单道移液器和枪头，8道移液器（排枪
2、）和枪头6. PBS三、操作步骤1. 水浴锅调至37。2. 蛋白标准品工作液（1 mg/ml）的配制：将蛋白标准品（5mg/ml）从-20冰箱中取出，完全溶解并混匀。取60l 蛋白标准品（5mg/ml），加入240l PBS，即稀释5倍，即配成蛋白标准品工作液（1 mg/ml）。3. 计算BCA工作液总量= 0.2 ml（样本数+8）21.1（标准品和样本均需测复孔）。BCA工作量按50体积的BCA试剂A加上1体积的BCA试剂B配制（即50:1），需充分混匀。BCA工作液室温24小时内稳定。样本数(n)15678101112131415161719202122232426A（ml）678910
3、1112131415B（ml）0.120.140.160.180.20.220.240.260.280.3总量(ml)6.127.148.169.1810.211.2212.2413.2614.2815.34. 按下表配制8个蛋白标准液（S0S7），充分摇匀。单条酶标板蛋白标准品工作液（1 mg/ml）(ml)PBS(ml)蛋白标准品终浓度(mg/ml)AS001000BS15950.05CS210900.1DS320800.2ES430700.3FS540600.4GS650500.5HS710001.05. 将96孔酶标板的A1孔放在左上角，按下表加入蛋白样本和标准品。（1） 先在第34条
4、酶标板的蛋白样本孔（N 1N8）中加入待测蛋白样本各2l，再用排枪在蛋白样本孔中追加PBS液各18l，使总量达到20l。（此时蛋白样本的稀释比为10，适用于预计蛋白浓度为28mg/ml时。如预计蛋白浓度太高或太低，可适当调整稀释比例）（2） 再在第12条酶标板的蛋白标准品孔（S0S7）中加入上面配制的8个蛋白标准液各20l。123456789101112AS0S0N1N1BS1S1N2N2CS2S2N3N3DS3S3N4N4ES4S4N5N5FS5S5N6N6GS6S6N7N7HS7S7N8N86. 用排枪在各孔中加入200l BCA工作液，轻轻摇匀，37放置30分钟或室温放置2小时。（注意：每次测定时必须都做标准曲线。因为BCA法测定时颜色会随着时间的延长不断加深，且显色反应的速度和温度有关，所以除非精确控制显色反应的时间和温度，否则每次都做标准曲线。如果浓度较低，可适当地延长孵育时间或在较高温度孵育。）7. 用酶标仪测定562nm下标准品和样本的吸光度。8. 用标准蛋白质量为横座标，用吸光度值A562为纵座标，做标准曲线，用线形回归计算公式Y=A X + B。根据样本的吸光度，计算待测样本的蛋白浓度（注意待测样本的稀释倍数）。9. 按WB实验的要求，稀释为2.5mg/ml，分装为每支100l。2
