1、细胞免疫组化 细胞爬片的免疫组化1.细胞爬片，5天后进行免疫细胞组织化学染色定。2. PBS清洗标本 3次 各 1 min。3 .冰丙酮固定 15 min(或4%多聚甲醛固定30min)。4. 空气干燥 5min。5. PBS清洗标本 3次 各 2 min。6. 0.5%Triton X-100( DPBS配 ) 孵育 1次 20min。7. PBS清洗标本 3次 各 2 min。8 .3%H2O2（试剂A）孵育 15 min。9. DPBS清洗标本 3次 各 2 min。10. 封闭血清孵育（试剂B） 20min。11 .一抗孵育（滴度1：200，湿盒）4 过夜或3760 min。阴性对照最
2、好用一抗来源血清，否则用PBS液12. PBS清洗标本 3次 各 5 min。13 .二抗工作液孵育（湿盒试剂C） 3730 min。14 .PBS清洗标本 3次 各 5 min。15. 试剂D（湿盒） 37 30 min。16、PBS清洗标本 3次 各 5 min。17、DAB显色（避光，镜下观察至棕色 ） 约310min。18、蒸馏水洗 2次 1 min。19、苏木素复染 0.51min。20、自来水洗返蓝。21.梯度酒精脱水75，85，95，100%各3min。22.二甲苯透明2次3min。23、中性树胶封片。注意事项：1、良好的细胞爬片是进行免疫组织细胞的基础，要获得良好细胞爬片须注意
3、以下：a对于粘附分子较少的细胞爬片时间要达5天以上这样细胞爬片才较牢固冲洗时不易脱片；b接种的细胞密度适中以2*104/ml为宜，若密度太高5天后细胞连接成片冲洗时易脱片；2、冰丙酮固定后玻片可密闭保存于4C冰箱，冰丙酮固定时会使细胞收缩，可用80%冰丙酮或2%多聚甲醛固定。3、冲洗时只须轻轻振荡培养皿，（不可用吸管太用力吹，易脱片）4、加一抗、二抗后冲洗时第一次须将玻片倾斜5、Triton X-100表面活性剂，脱去细胞膜中最主要的成分脂质，对于抗原表达在胞浆或胞核者方使用，对于抗原表达在胞浆者时间要控制好，使其破坏细胞膜而核膜破坏较少。 细胞爬片固定后在孔板里做免疫组化还是粘到载玻片上再做
4、？ 1.如果不看荧光，两种都可以，感觉粘好了再做要快一些，但是做的时候要防止脱落。如果看荧光，就不能用中性树胶粘，直接在24孔，或6孔板里做才可以。中性树胶要折光，散射的光干扰，没办法看细胞本身的荧光。 2.孔板里做免疫组化较方便，细胞比盖玻片易贴壁，但染色后不能用二甲苯透明、封片（可用甘油）。细胞爬片固定后粘到载玻片上不太可能，只有开始就让细胞贴在玻片上爬片。3.我没有在多孔板里做过，其实把细胞爬在盖玻片上也不是很麻烦，偶这样做很少掉片。先将消化好的细胞悬液滴几滴在盖玻片上，由于液体的表面张力，细胞悬液一般不会流淌到盖玻片外面，等细胞大概贴壁后，不同细胞贴壁时间稍有不同，大概6、7个小时，差
5、不多贴壁再加生长液，开始滴的细胞的数量你要摸索一下，到固定时细胞生长到80左右比较合适。 偶是在盖玻片上做的， 首先细胞要爬的匀一些，象dongwp战友的就很好。然后倾去生长液冲洗、固定之后，用小镊子或手指把玻片从六孔板拿出来。擦干盖玻片的背面，在玻片背面四周涂一点凡士林，粘贴于载玻片上，这一点很重要，在以后的操作里会省去盖玻片经常脱落麻烦。 细胞爬片的保存和抗原修复问题总结 1. 细胞爬片可以用 含 叠氮钠PBS液保存.但不知道具体浓度,请告知.多谢!加在液体中作为防腐剂的叠氮钠浓度一般为0.04-0.08%。但是我建议对于细胞爬片，还是尽量快的进行处理，以防不必要的问题!2. louisc
6、hen wrote:但我的细胞爬片经过4%多聚甲醛固定，PBS冲洗后直接就放在了-20度，还能用于免疫组化吗?!应该没有问题，但是还是现作先染好些，以防抗原的丢失3. mRNA原位杂交经4%多聚甲醛固定,固定液需加DEPC水。其它建议用甲醇固定。-20度保存4. 如果是4%多聚甲醛固定，然后放在PBS中保存，在4度冰箱里保存两周没问题。时间再长就没试过了。5. 丙酮中固定5-10分钟，然后风干，放置4度保存过夜应该是没有问题。不要固定过夜，蛋白质固定过度，会影响抗原的暴露，影响免疫组化结果。如果是胞浆或胞核抗原出现假阴性结果，可考虑应用0.5%的triton-100孵育30分钟，渗透细胞膜。如
7、果玻片没有经过特殊处理，不要用其他抗原修复的方法，会造成掉片，我曾有过这方面的体会6. 丙酮固定后，PBS洗涤3次，即可保存至4度冰箱备用。7. (1)细胞爬片先用TBS洗3次，每次5分钟(2)4%多聚甲醛固定，室温，20分钟(3)70%-80%-90%-95%-100%梯度酒精脱水，通风橱内干燥，-80度保存。2周没有问题的，我保存过2个月都有信号，不过还是保存时间短一点的好8. 我的心肌细胞爬片用不同浓度的乙醇依次脱水后,就放在室温中,因为是要拍电镜,但是学校电镜坏了,呵呵,所以放了一个月后去拍,还是很好9. 细胞爬片用4%多聚甲醛或冷丙酮等固定，用PBS冲洗后，晾干，放在-20度保存一个
8、月没有问题的。10. 细胞爬片，有机溶剂如4%多聚甲醛或冷丙酮等固定后，轻轻摇动玻片或培养皿等，静置2min左右，弃去固定液，不用PBS洗而是采用空气干燥，干燥后的标本可于-70长期保存。解冻时要小心抗原破坏，应先将标本转移于干冰预冷的固定液，然后再将混合液转移至室温下，固定液到达室温时取出标本，再用PBS冲洗，在做以后的步鄹11. 我也做过细胞爬片的组化染色，不过没有遇到类似的问题。细胞培养好后用PBS洗一遍，然后4%多聚甲醛4度固定15分钟，自然风干。室温保存几周内都可以用的。我想这可能与抗原的类型有关，有的对氧化等损伤比较敏感，有的差一些。最好避光保存在4度，同时尽量隔绝空气。免疫荧光与
9、普通DAB显色差别只再二抗的标记，样品的保存应该是没有多大差别的。12. 细胞爬片丙酮固定后-20度保存，现在要再做免疫荧光，将保存的爬片拿出37度复温然后常规操作就可以了13. 爬片做免疫组化的优势在于抗原新鲜，细胞形态保存较好。若爬片需长期保存并出现你这样的问题，原因可能是：1)试验步骤有误，建议重复并加阳性对照片。2)加一抗前处理同石蜡切片，可进行抗原修复，如胰酶消化或热修复。3)因为抗原抗体反应在液相中进行，故对已极度干燥的爬片充分水化很重要。建议试验前用PBS浸泡过夜。如不能解决你的问题请QQ联系：81825645。本人在湖南省肿瘤医院病理科(长沙市)做免疫组化。14. 4%多聚甲醛
10、或冷丙酮固定都可以，也有用无水酒精的，固定好后放-20度，2-3个月是没有问题的。15. 对于一般的细胞免疫组化，我的做法是：细胞爬片用冰的纯丙酮固定20MIN，再在通风柜将丙酮吹干，-20度保存，用丙酮固定作用是沉淀蛋白质和糖，穿透性很强，保存抗原的免疫活性好。所以丙酮常用做细胞细胞爬片的固定剂。当然还是要根据你的实验目的决定用那种固定剂。如：1.多聚甲醛(常用4%)：可用于免疫电镜;也可用于免疫荧光染色。 主要检测组织内一些性能娇弱的抗原特别是细胞表面抗原，例如各类淋巴细胸分化决定簇(CD)、主要组织相容性抗原等2.乙醇。优点：穿透性强、抗原性保存较好。缺点：但醇类对低分子蛋白质、多肽及胞
11、浆内蛋白质保存效果较差，使蛋白变性的作用轻，固定后可再溶解;染色过程中，温育时间长，抗原可流失而减弱反应强度3.甲醛(福尔马林)应用最广 优点：形态结构保存好，且穿透性强， 缺点： 甲醛放置过久可氧化为甲酸，使溶液pH降低，影响染色; 分子间交联形成的网格结构可能部分或完全掩盖某些抗原决定簇，使之不能充分暴露。可造成假阴性的染色结果。16. 4度是不能保存这么长时间(1个月)的，如果抗原已被分解，再修复也没用!17. 弃去固定液，不用PBS洗而是采用空气干燥，干燥后的标本可于-70长期保存。18. 爬片置于37度PBS中洗三次，每次3到5秒钟，然后在4%多聚甲醛中固定15分钟，然后再用37度去
12、离子水将甲醛冲干净，注意手法轻柔，要不然掉片很厉害。同时操作过程中注意玻片的正反面，要不然真的是前功尽弃。将做好的爬片置于滤纸上晾干，然后用中性树胶粘在载玻片上。注意一定要等中性树胶彻底干了之后才能做后续实验，要不然玻片会掉下来的，就又是前功尽弃了 做好的细胞爬片可以放在-20保存备用，具体能保存多长时间不太清楚，当然尽量早用。19. 固定后放点PBS，然后放在4度冰箱中保存，我最长保存两个月的，然后再做免疫组化，应该没有太大的问题的。20. 固定后4度可以存放一周，-20度存放半年，我现在也要做这个，实验室老师教的。21. 四度放1周应该没问题的，你最好放在-20度，我在-20度放一个月都还
13、出结果的.很多人作的片子很多，不可能一次作完，一个月没问题.22. 最佳的固定及保存方法：(1)中性缓冲福尔马林(不必调pH)：福尔马林(40%甲醛，用时加入过量碱式MgCO3中和) 10.0mlNa2HPO4.12H2o 1.9653gNaH2PO4.2H2O 0.5460g加0.85 %NaCl溶液溶解，定容至100ml。(2)细胞固定：待细胞接近长成单层时，用镊子取出盖玻片，迅速于37PBS中漂洗2次，每次3-5秒，以清除血清。(3)将盖玻片投入中性缓冲福尔马林溶液中室温固定30min。(4)用镊子取出盖玻片，PBS漂洗2次，每次3-5秒，晾干保存于-20备用。可长期保存，做实验时，取出
14、片子，入PBS湿润后即可进行你的实验。可以用于做免疫细胞化学(H.E.)或免疫荧光。(本帖没有加分)23. 细胞爬片固定以后要放在-20度的冰箱.1个月内可以用.24. skywalkerzz wrote:过氧化氢处理这一步，用三蒸水稀释商品浓度为30%的过氧化氢，然后室温下玻片放在其中浸泡10min，是不是过氧化氢导致细胞严重脱片?爬片应该用甲醇/双氧水，你的细胞极可能是过氧化氢导致严重脱片25. 本人比较喜欢用4%得多聚甲醛，20分钟很好用的。保存的时候注意片子最好晾干，不要挤压，防止粘片和碎裂。26. 细胞爬片固定好以后，如果要保存，我们的做法是倒掉固定液，PBS漂洗后干片保存在4度，最
15、长半年没问题。27. 1、用新鲜配制的预冷的4%多聚甲醛缓冲液室温固定15 min，PBS (0.01 mol/l, pH7.4)洗涤3遍后是否就可以进行免疫细胞化学染色了2、爬片PBS (0.01 mol/l, pH7.4)洗涤3遍后是否能保存，怎样保存?1、洗过就可以做免疫组化了。2、固定过后自然干燥，不要洗，-20度保存。做之前再洗。28. 细胞固定最好用丙酮或酒精，不要用4%多聚甲醛，以免抗原交联，这样组化时不用再抗原修复。细胞固定后可室温保存在丙酮中，不使之干燥。29. 如果是检测膜上的物质,好象不能用酒精,30. 适当密度后取出固定(丙酮-20固定1020min)，再进行免疫染色。31. 一批细胞爬片,如果细胞爬片是在玻璃上，冷丙酮固定15-20分钟，然后放-20度，没有问题。如果细胞爬片是在24孔板或6孔板里进行，冷丙酮会腐蚀板子，最好4%多聚甲醛。32. 细胞爬片用纯丙酮固定10分钟，取出干燥后用锡纸包裹，-70度保存。33. 4%多聚甲醛固定
