1、病理新技术在子宫颈病理新技术在子宫颈CIN的应用的应用 河南省人民医院病理科 孔令非 病理学新技术 FISH 原位杂交 免疫组织化学 生物传感器 荧光原位杂交荧光原位杂交 Fluorescence in situ hybridization 原理原理 利用DNA碱基对的互补性，将直接标记了荧光的单 链DNA(探针)和与其互补的目标样本的DNA(玻片上 的标本)杂交,通过观察荧光信号在染色体上的位 置反映相应染色体的情况 FISH操作 样本预处理样本预处理 脱蜡，脱水及水化，消化，脱蜡，脱水及水化，消化，探针、样本变性探针、样本变性 78 78 探针样本杂交探针样本杂交 4545-5050 杂交
2、后洗涤杂交后洗涤 结果观察结果观察 FISH FISH 探针种类探针种类 CSP着丝粒探针着丝粒探针 GLP特异性位点探针特异性位点探针 染色体整臂探针 FISHFISH探针的类型探针的类型 全染色体涂抹探针全染色体涂抹探针 （WCPWCP）染色体计数（着丝粒）探针染色体计数（着丝粒）探针（CSPCSP）位点特异性探针（位点特异性探针（GLPGLP）单色特异性探针单色特异性探针 双色分离重排探针双色分离重排探针 双色双融合易位探针双色双融合易位探针 IgH Bcl2 IGH/BCL2探针探针 14（灰）号和（灰）号和18号（黑）染色体号（黑）染色体 IgH基因基因 Bcl-2基因基因 杂交杂交
3、 融合融合 基因扩增基因扩增 双色双融合易位探针双色双融合易位探针(IGH/BCL2(IGH/BCL2）FISHFISH的特点的特点 操作简单 检测快速 结果易观察 灵敏性和特异性高 可检测样本种类多 空间定位精确 FISH检测在临床中的应用 产前诊断 血液病检测 实体瘤检测 端粒，端粒酶及作用 端粒是真核细胞染色体末端的特殊NDA-蛋白结构，其DNA含大量TTAGGG重复序列，在进化中高度保守 DNA酶不能复制线性DNA（端粒是线性DNA）大多数体细胞的端粒会随周期性复制而缩短，最终达到一个使染色体完整性丧失的临界点，细胞增殖停止；许多肿瘤细胞端粒酶活性增高，是肿瘤细胞增殖的关键步骤 作用：
4、保护染色体基因组免受降解或重组 为染色体末端提供一种可消耗的非编码序列，以缓解或取消末端复制所带来的染色体DNA进行性缩短 生殖细胞具有端粒酶活性，其端粒不随年龄增加而缩短，故成为永生细胞 端粒酶由RNA，DNA及蛋白质组成，本质是一种逆转录酶 端粒酶活性决定于端粒酶RNA（human telomerase RNA,hTERChTERC)和端粒酶催化亚单位(human telomerase reverse transcriptase,hTERThTERT)hTERC是端粒长度稳定的直接因素 保持端粒稳定、基因组完整、细胞长期有活性和潜在的继续增殖能力 人端粒酶基因位于3q26.3，该基因的扩增
5、可阻止细胞凋亡，导致肿瘤产生 宫颈脱落细胞及组织学FISH探针 CSP3 TERC hTERChTERC基因定位于基因定位于3q26.33q26.3 3 3号染色体着丝粒信号号染色体着丝粒信号 0.0020.0040.0060.0080.00100.00120.00Norm/InflaCIN 1CIN 2CIN 3SCCPathological diagnosishTERC positive rate(%)Center 1Center 2Center 30.0020.0040.0060.0080.00100.00120.00Norm/InflaASCUSASC-HLSILHSILCytolog
6、ical resultshTERC positive rate(%)Center 1Center 2Center 3All the three centers obtained similarly increasing trend of hTERC positive rates according to the severity of cervical lesions,for both cytological results and pathological diagnosis.中国8350例子宫颈病变TERC扩增 TBSTBS分级分级 正常正常/炎症炎症 ASCUSASCUS ASCASC-
7、H H LSILLSIL HSILHSIL TERCTERC基因扩增发生率（基因扩增发生率（%）4.64.6 13.513.5 28.628.6 25.225.2 87.787.7 病理分级病理分级 正常正常/炎症炎症 CIN 1CIN 1 CIN 2CIN 2 CIN 3CIN 3 浸润癌浸润癌 TERCTERC基因扩增发生率（基因扩增发生率（%）4.24.2-10.610.6 26.826.8 65.465.4 83.183.1 93.593.5 hTERC检测临床意义 伴有hTERC基因扩增的癌前病变的病人有52%96%的恶变可能。可预测CIN1/CIN2 向CIN3发展的风险因素，其灵
8、敏度是100%，特异性是 70%.FISH是早期诊断和风险预测的有效手段(AJP April 2005,Vol.166,No.4)hTERChTERC基因检测在宫颈癌和宫颈癌基因检测在宫颈癌和宫颈癌前病变诊断中有重要价值前病变诊断中有重要价值 魏丽惠，李亚里，吴瑞芳，陈忠，屠铮，江静，李静然 北京大学人民医院妇科，北京，中国 中国解放军总医院妇科，北京，中国 北京大学深圳医院妇产科，深圳，中国 犹他大学医学遗传学科，盐湖城，美国 该研究显示，采用FISH技术检测hTERC基因扩增可在宫颈细胞学玻片上进行，具有无创性和客观性的特点，敏感度和特异度高，在宫颈癌和宫颈癌前病变的诊断中有重要价值。hT
9、ERC基因的异常扩增可能成为宫颈病变恶性进展的早期标记物。北京协和医院郎景和教授点评：北京协和医院郎景和教授点评：在液基细胞学检查和检测人乳头状瘤病毒筛查宫颈癌的同时，检测hTERC基因，有望成为协助宫颈癌和宫颈癌前病变诊断及预测癌前病变是否向子宫颈癌发展的重要指标，而造福广大妇女。细胞非典型性发育异常细胞非典型性发育异常 细胞癌变细胞癌变 阻止细胞正常凋亡阻止细胞正常凋亡 高危型高危型HPVHPV持续性感染持续性感染 人类染色体端粒酶基因人类染色体端粒酶基因(hTERC)(hTERC)扩增扩增 致癌基因致癌基因E6/E7E6/E7编码的原癌蛋白表达编码的原癌蛋白表达 TERC基因的扩增可阻止
10、细胞凋亡，导致肿瘤产生 P16P16表达表达 E7结合结合RB E6结合结合p53 随着宫颈病变级别增加，hTERC的阳性率增加 hTERC阳性率 正常或炎症组 4.2-10.6%CIN1组 26.8%CIN2组 69.23%CIN3组 83.58%宫颈癌组 95.65%正常及正常及CIN1CIN1的的hTERChTERC基因阳性率明显低于基因阳性率明显低于CIN2CIN2及以上者，及以上者，P P 0.010.01 hTERC诊断CIN2或CIN2以上病变 敏感度 81.40%特异度 95.04%阳性预测值 70.00%阴性预测值阴性预测值 97.29%97.29%Human Papillo
11、ma Virus(HPV)环状双链DNA病毒 超过120种亚型 其中的72种亚型可引起肛门及生殖器疾病 Low risk(LR-HPV):6,116,11,40,42,44,54,61,70,72,81,40,42,44,54,61,70,72,81 High risk(HR-HPV):16,18,16,18,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59,63,731,33,35,39,45,51,52,56,58,59,63,78,828,82 HPV的生物学状态:游离或整合 在HPV感染的早期或瞬间感染，HPV基因组以游离的环状DNA形式存在于宿主细胞核中。(Condylom
12、a and CIN-1)持续的HPV感染，使其DNA整合进宿主DNA，标志着恶性转化。(CIN2lesions)持续性的HPV感染几乎总是发生在两种上皮的交界处（宫颈移行带、肛门和口咽）HPV通过宫颈鳞腺交界处感染基底细胞 或HPV通过微创伤直接感染基底细胞 临床治疗需要破坏移行带，而不仅仅是病临床治疗需要破坏移行带，而不仅仅是病变本身变本身 HPV 检测及预后预测价值 阴性预测价值(NPV)约 99%women not infected with HR-HPV have 1%chance to have HSIL lesion 阳性预测价值(PPV)根据患者的年龄:30:PPV gradua
13、lly increased with age and persistent HPV infection 原为杂交法 用标记的HPV探针在组织上或细胞上进行原位的杂交，并进行显色 特异性最强 敏感性高 直观 可结合组织学或细胞学形态 探针有：6/11,16/18,31/33 导流杂交法 扩增所取样本的DNA 放在固定好基因探针的基因芯片上（21种亚型包括13种高危亚型16,18,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59,68及5种低危亚型6,11,42,43,44和3种中国人群常见的亚型53,66,CP8304型进行杂交 探针标记Biotin及碱磷酶 用NBT/BCIP进行显色
14、 结果呈蓝紫色 判定标准判定标准RLU/CutoffRLU/Cutoff 的比值的比值 1=1=阳性阳性,50,50以内的数值对病情的严重程度并没有指示性，以内的数值对病情的严重程度并没有指示性，但但5050的数值对病情的严重程度的估计有指导意义。的数值对病情的严重程度的估计有指导意义。1=1=阴性，表示未检出阴性，表示未检出1313种高危型种高危型HPV DNAHPV DNA序列或标本中不含序列或标本中不含有高危型有高危型HPV DNAHPV DNA序列，又或者其浓度水平在测定方法的检测限序列，又或者其浓度水平在测定方法的检测限度以下，不能除外潜伏感染；度以下，不能除外潜伏感染；如果接近但小
15、于如果接近但小于1.01.0且被怀疑有高危型且被怀疑有高危型HPVHPV感染，应该重新采集感染，应该重新采集标本。标本。HC-II的应用条件 HPV test 不适用的情况：细胞学显示异型增生时 年龄30岁的女性,细胞学检查结合HPV test HPV检测方法的比较 原位杂交 导流杂交 基因捕获HC-II 原理 在原位进行HPV DNA的杂交 提取DNA进行PCR，进行膜杂交 DNA分解，DNA-RNA杂交，抗体捕获，特点 组织学及细胞学涂片上原位显示分型HPV 具体分型显示HPV,无病毒负荷的提示 只显示高危病毒感染，不具体分型，可提示病毒的负荷 敏感性及特异性 敏感性+特异性+敏感性+特异
16、性+敏感性+特异性+取材 组织或细胞涂片 阴道分泌物 阴道分泌物 生物传感器技术 24种HPV亚型，其中低危8种（6,11,40,42,43,44,54,70），高危16种（16,18,31,33,35,39,45,51,52,53,56,58,59,66,68,81）可检测HPV的载量 子宫颈细胞中HPV的情况 单独感染 混合感染（2、3，6种HPV型）子宫颈鳞状上皮病变中HPV感染 HPV检出率1(导流杂交）病毒种类1 HR-HPV检出率2（HC-II)尖锐湿疣 92%6,11,31,52 低级别CIN 89%16,31,18,52,33,6,11 74.93%高级别CIN 100%16,33,52,18 91.72%鳞状上皮增生 33%6,11,16,18 43.29%1.北京军区总医院病理科 2.解放军总医院妇产科 CIN中需注意的问题 CIN病变也可表现为鳞状上皮的表面上皮显著的不典型增生，而非基底层细胞，是CINI的病理基础 CIN病变累及腺体 一般：鳞状上皮CINIII，进一步向下发展延伸至腺体，但未突破基底膜 少数：鳞状上皮CINII，腺体鳞化也呈CINII，这时为表达
