1、1 细胞自噬机制细胞自噬机制 主讲人：晏剑虹主讲人：晏剑虹 克里斯汀克里斯汀 德德 迪夫（迪夫（Christian deDuve）比利时科学家比利时科学家Christian de DuveChristian de Duve在上世纪在上世纪5050年代通过电镜观察到年代通过电镜观察到自噬体（自噬体（autophagosomeautophagosome）结构，）结构，并且在并且在 1963 1963 年溶酶体国际会议年溶酶体国际会议（CIBA Foundation Symposium CIBA Foundation Symposium on Lysosomeson Lysosomes）上首先提出了
2、）上首先提出了“自噬”这种说法。因此“自噬”这种说法。因此Christian de DuveChristian de Duve被公认为自噬被公认为自噬研究的鼻祖。研究的鼻祖。Christian de Duve Christian de Duve 也因发现溶酶体，于也因发现溶酶体，于19741974年获得年获得诺贝尔奖诺贝尔奖 大隅良典大隅良典 2016年，因“在细胞自噬机年，因“在细胞自噬机制方面的发现”而获得诺贝尔制方面的发现”而获得诺贝尔生理学或医学奖。大隅教授的生理学或医学奖。大隅教授的贡献在于，他找到了酵母这种贡献在于，他找到了酵母这种简单又与人体细胞相似的实验简单又与人体细胞相似的实
3、验模型，将复杂的问题化难为易模型，将复杂的问题化难为易了。了。大隅良典大隅良典 宫崎骏宫崎骏 在酵母菌体内(左侧)存在一个巨大的细胞器，名为液泡，其功能与人以及其他哺乳动物体内细胞内的溶酶体相类似。于是他培养了经过改造，缺乏液泡膜降解酶的酵母菌并通过饥饿的方法激活细胞的自噬机制。此时，当这些酵母菌遭受饥饿时，吞噬小体开始在液泡内部大量聚集(右图)。大隅良典的实验证明酵母菌内部存在自噬现象。此后，大隅良典教授对数以千计的酵母菌变异样本进行了核对(右侧)，并从中找到了据信与自噬作用密切相关的15组基因。凋亡凋亡与自噬与自噬 表中可以看出，在过去的十年之中，几乎每个生命科学家都知道“凋亡”这个概表中
4、可以看出，在过去的十年之中，几乎每个生命科学家都知道“凋亡”这个概念并且有意无意将自己的研究工作与之挂钩。自噬（念并且有意无意将自己的研究工作与之挂钩。自噬（autophagyautophagy）是继凋亡）是继凋亡（apoptosisapoptosis）后，当前生命科学最热的研究领域，）后，当前生命科学最热的研究领域，PubmedPubmed记录的文献数量在最记录的文献数量在最近近4 4年呈爆炸式增长，其中年呈爆炸式增长，其中20062006年以前相关文献大约年以前相关文献大约15001500条。条。20072007年是自噬研究年是自噬研究有历史意义的一年，召开了第一次自噬国际会议，与会人员构
5、成自噬学术圈的奠有历史意义的一年，召开了第一次自噬国际会议，与会人员构成自噬学术圈的奠基者，并且在各自领域宣传和研究一些基本概念。基者，并且在各自领域宣传和研究一些基本概念。20072007年到年到20102010年年9 9月短短三年月短短三年文献发表量达到大约文献发表量达到大约44004400条。我们坚信在未来十年“自噬”也将会成为另一个条。我们坚信在未来十年“自噬”也将会成为另一个“万金油”和生命科学的“闪亮新星”。“万金油”和生命科学的“闪亮新星”。在大隅良典发现细胞自噬的关键机制之后，研究局面豁然开朗，相关论文发表量骤然上升。在大隅良典发现细胞自噬的关键机制之后，研究局面豁然开朗，相关
6、论文发表量骤然上升。细胞自噬的定义细胞自噬的定义 细胞自噬(autophagy)是真核生物中进化保守的对细胞内物质进行周转的重要过程。该过程中一些损坏的蛋白或细胞器被双层膜结构的自噬小泡包裹后，送入溶酶体(动物）或液泡（酵母和植物）中进行降解并得以循环利用。细胞自噬基本过程细胞自噬基本过程 自噬基本过程：自噬基本过程：1.1.自噬前体的形成自噬前体的形成 2.2.自噬体的形成自噬体的形成 3.3.自噬溶酶体的融合自噬溶酶体的融合 4.4.自噬体的溶解自噬体的溶解 内涵体 自噬内涵体 溶酶体 自噬溶酶体 自噬前体 自噬体 细胞自噬分类细胞自噬分类（根据进入溶酶体途径不同）（根据进入溶酶体途径不同
7、）巨自噬巨自噬 微自噬微自噬 分子伴侣介导的自噬分子伴侣介导的自噬 巨自噬巨自噬 内外刺激诱导下，细胞通过自噬基因调控组装自噬前体。自噬体内外刺激诱导下，细胞通过自噬基因调控组装自噬前体。自噬体包裹细胞质包裹细胞质,细胞器或细菌等形成自噬体，在微管作用下，自噬细胞器或细菌等形成自噬体，在微管作用下，自噬体与溶酶体靠近，自噬体外层膜与溶酶体膜融合，包有内层膜的体与溶酶体靠近，自噬体外层膜与溶酶体膜融合，包有内层膜的自噬体进入溶酶体，形成自噬溶酶体。继而，自噬体内膜被溶酶自噬体进入溶酶体，形成自噬溶酶体。继而，自噬体内膜被溶酶体酶降解，继而内容物被降解，营养成分被细胞重新利用。体酶降解，继而内容物
8、被降解，营养成分被细胞重新利用。微自噬微自噬 主要集中于酵母。当受到饥饿等刺激时，溶酶体膜局部凹陷，吞噬细胞质或微体，形成自噬体。自噬体脱离溶酶体膜，进入溶酶体腔，由溶酶体酶降解，降解物质被细胞再利用。分子伴侣介导的自噬（分子伴侣介导的自噬（CMACMA）分子伴侣介导的自噬（分子伴侣介导的自噬（CMACMA）：胞质内蛋白结合到）：胞质内蛋白结合到分分子伴侣子伴侣后被转运到溶酶体腔中，然后被溶酶体酶消后被转运到溶酶体腔中，然后被溶酶体酶消化。化。CMA CMA 的底物是可溶的蛋白质分子，在清除蛋白的底物是可溶的蛋白质分子，在清除蛋白质时有选择性，而前两者无明显的选择性。质时有选择性，而前两者无明
9、显的选择性。分子伴侣：分子伴侣：一类在序列上没有相关性但有共同功能的蛋白质，它们在细胞一类在序列上没有相关性但有共同功能的蛋白质，它们在细胞内帮助其他含多肽的结构完成正确的组装，而且在组装完毕后与之分离，内帮助其他含多肽的结构完成正确的组装，而且在组装完毕后与之分离，不构成这些蛋白质结构执行功能的组份不构成这些蛋白质结构执行功能的组份 自噬的特性自噬的特性 1）自噬是细胞消化掉自身的一部分，即self-eating，初一看似乎对细胞不利。事实上，细胞正常情况下很少发生自噬，除非有诱发因素的存在。这些诱发因素很多，也是研究的热门。既有来自于细胞外的（如外界中的营养成分、缺血缺氧、生长因子的浓度等
10、），也有细胞内的（代谢压力、衰老或破损的细胞器、折叠错误或聚集的蛋白质等）。由于这些因素的经常性存在，因此，细胞保持了一种很低的、基础的自噬活性以维持自稳。2）自噬过程很快，被诱导后8min即可观察到自噬体（autophagosome）形成，2h后自噬溶酶体（autolysosome）基本降解消失。这有利于细胞快速适应恶劣环境。3）自噬的可诱导特性：表现在2个方面，第一是自噬相关蛋白的快速合成，这是准备阶段。第二是自噬体的快速大量形成，这是执行阶段。4）批量降解：这是与蛋白酶体降解途径的显著区别 5）“捕获”胞浆成分的非特异性：由于自噬的速度要快、量要大，因此特异性不是首先考虑的，这与自噬的应
11、急特性是相适应的。6）自噬的保守性：由于自噬有利于细胞的存活，因此无论是物种间、还是各细胞类型之间（包括肿瘤细胞），自噬都普遍被保留下来（谁不喜欢留一手呢？）。微管相关蛋白轻链微管相关蛋白轻链3 3（MAPMAP-LC3LC3）12135-1-AP 微管相关蛋白轻链微管相关蛋白轻链3（MAP-LC3），简称），简称LC3，参与了自噬的形成，并被证明了是哺乳动物细胞中常见的自噬小，参与了自噬的形成，并被证明了是哺乳动物细胞中常见的自噬小体标记蛋白之一体标记蛋白之一。Western blot可能会检测到LC3的两种形式，这是由于自噬形成时，胞浆型LC3会酶解掉一小段多肽形成LC3-I，LC3-I跟
12、磷脂酰乙醇胺即脑磷脂(PE)结合转变为（自噬体）膜型（即LC3-II），这两种形式在正常细胞中都是存在的，而发生自噬的细胞中LC3-II会有明显的增加。自噬小体的增多有两种可能自噬小体的增多有两种可能 一是形成增加即自噬被诱导；另外一种是自噬体成熟受抑即自噬体不能和溶酶体结合。自噬诱导剂 1）Bredeldin A/Thapsigargin/Tunicamycin：模拟内质网应激 2）Carbamazepine/L-690，330/Lithium Chloride（氯化锂）：IMPase 抑制剂（即Inositol monophosphatase，肌醇单磷酸酶）3）Earles平衡盐溶液：制造
13、饥饿 4）N-Acetyl-D-sphingosine（C2-ceramide）：Class I PI3K Pathway抑制剂 5）Rapamycin：mTOR抑制剂 6）Xestospongin B/C：IP3R阻滞剂 自噬的抑制剂自噬的抑制剂 根据自噬形成的过程，自噬的抑制也分为不同的阶段，包括自噬的起始阶段，自噬泡和溶酶体融合阶段，以及溶酶体内的降解阶段。目前常用的一些抑制药物如下：（1）对自噬体形成的抑制：主要是PI3K通路的抑制剂（如3-MA），这些药物均可干扰或阻断自噬体形成。（2）对自噬体与溶酶体融合的抑制：对自噬体与溶酶体融合过程进行阻断也能起着抑制自噬的作用，这些药物有巴伐
14、洛霉素A1、长春碱、诺考达唑等。（3）对溶酶体降解的抑制：蛋白酶抑制剂，如E64d、Pepstatin A等 自噬体的检测自噬体的检测 （1）以透射电子显微镜下超微结构的形态学检测。（2）自噬体膜标志性蛋白质的检测。（3）单丹(磺)酰戊二胺(MDC)染色法。（4）检测长寿蛋白的批量降解 （5）CellTrackerTM Green染色 细胞自噬功能细胞自噬功能 （1）细胞自噬通过防御环境变化和应激代谢反应调控来维持细胞内部 的稳态。（2）细胞自噬具有自我“清理”功能，可以处理细胞内的废物，降解 错误折叠的 蛋白质多聚体，减少DNA的损伤和染色体的不稳定性，防止异常蛋白质累积，还能降解功能 失常
15、的线粒体、高尔基体等 细胞器，对蛋白质和细胞器进行质量控制，并且通过降解底物来为细胞生存提供原材料或ATP （3）细胞自噬甚至可以清除细胞内的病原体，保护细胞免受损伤，对于对抗癌症、衰老、神经退行性病变、感染等都有着重要的意义。（4）细胞自噬是程序性细胞死亡的一种，在某些情况下，若细胞无法 继续维持自身的生存，细胞自噬会诱导细胞主动性死亡。细胞自噬与肿瘤的治疗细胞自噬与肿瘤的治疗 自噬与肿瘤的关系自噬与肿瘤的关系 与凋亡（在肿瘤细胞中一般都存在缺限）不同，自噬是被优先保留的。无论是肿瘤细胞还是正常细胞，保持一种基础、低水平的自噬活性是至关重要的。因为细胞中随时产生的“垃圾”（破损或衰老的细胞器
16、、长寿命蛋白质、错误合成或折叠错误的蛋白质等等）都需要及时清除，而这主要靠自噬来完成，因此，自噬具有维持细胞自稳的功能；如果将自噬相关基因突变失活，如神经元会发生大量聚集蛋白，并出现神经元退化。同时，自噬的产物，如氨基酸、脂肪酸等小分子物质又可为细胞提供一定的能量和合成底物，可以说，自噬就是一个“备用仓库”。如Atg-5缺陷的小鼠在出生后喝上第一口奶之前就会饿死。更重要的是，自噬活性可在代谢应激（饥饿、生长因子缺乏、射线、化疗等）时大大增强 ，表现为胞浆中迅速涌现大量自噬体，这一现象被称为“自噬潮”（autophagic flux），广泛用于自噬形成的监测。自噬潮为细胞度过危机提供了紧急的营养和能量支持，有利于细胞的存活。自噬可为肿瘤细胞带来几大好处自噬可为肿瘤细胞带来几大好处 1）肿瘤细胞本身就具有高代谢的特点，对营养和能量的需求比正常细胞更高，但肿瘤微环境往往不能如意，如肿瘤发生初始期到血管发生之前、肿瘤长大发生血管崩塌时、肿瘤细胞脱离原发灶游走时等都会出现营养不足或供应中断，而此时提高自噬活性可以有助于度过这一危机。2）当化疗、放疗后，肿瘤细胞会产生大量的破损细胞器、损坏的蛋白质
