1、 20112011年食品企业质量检年食品企业质量检验人员培训验人员培训 2011.09.15 菌落总数与大肠菌群的测定菌落总数与大肠菌群的测定 二、二、大肠菌群的检测大肠菌群的检测 一、一、菌落总数测定法菌落总数测定法 太仓市产品质量监督检验所 主讲人：詹克航主讲人：詹克航 2011.09.15 目前目前，食品卫生标准中的微生物指标一般分为食品卫生标准中的微生物指标一般分为菌落菌落总数总数、大肠菌群和致病菌大肠菌群和致病菌三项三项。细菌计数细菌计数 食品中菌落总数通常指食品中菌落总数通常指1g，1ml或或1cm2面积食品上的面积食品上的细菌数目而言的细菌数目而言的，而不考虑其种类而不考虑其种类
2、。由于检测计数方法的不同由于检测计数方法的不同,一般有两种表示方法一般有两种表示方法（菌落菌落总数总数和和细菌总数细菌总数）。食品卫生标准中的微生物指标概论食品卫生标准中的微生物指标概论 菌落总数:菌落（Colony）菌落菌落(colony)：生长在固生长在固体培养基上，来源于一个体培养基上，来源于一个细胞，肉眼可见的细胞群细胞，肉眼可见的细胞群体。体。一种一种是在严格规定条件下是在严格规定条件下（样品处样品处理理，培养基及其培养基及其pH培养温度与时间培养温度与时间、计计数方法等数方法等），使适应这些条件的每一个使适应这些条件的每一个活菌细胞必须而且只能生成一个肉眼可活菌细胞必须而且只能生成
3、一个肉眼可见的菌落见的菌落，经过计数所获得的结果称为经过计数所获得的结果称为该该食品的菌落总数食品的菌落总数。另一种另一种是将食品经过适当处理（溶解和稀是将食品经过适当处理（溶解和稀释）后，在显微镜下对细菌细胞数进行直释）后，在显微镜下对细菌细胞数进行直接计数，这样计数的结果，既包括活菌，接计数，这样计数的结果，既包括活菌，也包括尚未被分解的死菌体，因此称为也包括尚未被分解的死菌体，因此称为细细菌总数菌总数。目前我国食品卫生标准中规定的细菌总目前我国食品卫生标准中规定的细菌总数实际上是指数实际上是指菌落总数菌落总数。即指的是在平板。即指的是在平板计数培养基上长出的菌落数。计数培养基上长出的菌落
4、数。那么检测食品中的菌落总数有何卫生学意义呢那么检测食品中的菌落总数有何卫生学意义呢？一方面一方面，它可以作为它可以作为食品被污染程度的标志食品被污染程度的标志。检测食检测食品中的菌落总数品中的菌落总数，可以了解食品在生产中可以了解食品在生产中，从原料加工从原料加工到成品包装受外界污染的情况到成品包装受外界污染的情况从而反映食品的卫生质从而反映食品的卫生质量量。一般来说一般来说、菌落总数越多菌落总数越多，说明食品的卫生质量越说明食品的卫生质量越差差，遭受病原菌污染的可能性越大遭受病原菌污染的可能性越大。而菌落总数仅少量而菌落总数仅少量存在时存在时，病原菌污染的可能性就会降低或者几乎不存在病原菌
5、污染的可能性就会降低或者几乎不存在。许多实验结果表明许多实验结果表明，食品中细菌总数能够反映出食品中细菌总数能够反映出食食品的新鲜程度品的新鲜程度、是否变质以及生产过程的一般卫生状况是否变质以及生产过程的一般卫生状况等等。一般来讲一般来讲，食品中细菌总数越多食品中细菌总数越多，则表明该食品污则表明该食品污染程度越重染程度越重，腐败变质的可能性越大腐败变质的可能性越大。另一方面另一方面，它可以用来它可以用来预测食品可能存预测食品可能存放的期限程度放的期限程度。如实验表明如实验表明，菌数为菌数为105cfu/cm2的鱼的鱼，在在0下可保持下可保持6d，而而菌数为菌数为103cfu/cm2时时，保存
6、期可达保存期可达12d。但上述规则也有例外但上述规则也有例外，有些食品成品有些食品成品的的菌落总数并不高菌落总数并不高，但由于已有细菌繁殖但由于已有细菌繁殖并并已产生了毒素已产生了毒素，且毒素性状稳定且毒素性状稳定，仍存仍存留于食品中；再有一些食品如酸泡菜和酸留于食品中；再有一些食品如酸泡菜和酸乳等乳等，本身就是通过微生物的作用而制成本身就是通过微生物的作用而制成的的，且是活菌制品且是活菌制品。自然界细菌的类很多自然界细菌的类很多，各种细菌的生理特性和所要求的生各种细菌的生理特性和所要求的生活条件不尽相同活条件不尽相同，（如如嗜温菌嗜温菌30-37，4.83hr；嗜冷菌嗜冷菌 20-25 5-
7、7d或或5-10 10-14d；嗜热菌嗜热菌 45-55 2-3天天）如果要检如果要检验样品中所有种类验样品中所有种类，必须用不同培养基及不同培养条件去满足必须用不同培养基及不同培养条件去满足其要求其要求，才能把各种细菌都检验出来才能把各种细菌都检验出来，这样工作量将会很大这样工作量将会很大。我们也知道我们也知道，自然界尽管细菌种类很多自然界尽管细菌种类很多，但但异养异养、中温中温、好气性细菌占绝大多数好气性细菌占绝大多数。因此因此，严格讲严格讲，用这种方法所得到的用这种方法所得到的结果结果，主要是一些主要是一些能在能在平板计数琼脂培养基平板计数琼脂培养基上生长的上生长的，好氧性好氧性嗜温细菌
8、的菌落总数嗜温细菌的菌落总数。但是把它们作为细菌总数已得到公认但是把它们作为细菌总数已得到公认。这不仅在食品的卫生检验中这不仅在食品的卫生检验中，而且在一切微生物区系分析中而且在一切微生物区系分析中，都把它们作为了细菌总数的指标都把它们作为了细菌总数的指标。注意：是并不是所有食品都规定细菌指标注意：是并不是所有食品都规定细菌指标，如酸乳如酸乳、酸泡酸泡菜等菜等。因此因此，菌落总数的测定对评价食品的新鲜菌落总数的测定对评价食品的新鲜度和卫生质量有着一定的卫生指标的作用度和卫生质量有着一定的卫生指标的作用，但本能单凭此一项指标来判定食品的卫生但本能单凭此一项指标来判定食品的卫生质量质量，还必须配合
9、大肠菌群和致病菌等检还必须配合大肠菌群和致病菌等检验验，才能作出比较全面才能作出比较全面、准确的评价准确的评价。一、菌落总数测定法一、菌落总数测定法 菌落总数菌落总数（aerobic plate count）食品检样经过处理，在一定条件下培养后食品检样经过处理，在一定条件下培养后(如培养如培养基成分、培养温度和时间、基成分、培养温度和时间、pH、需氧性质等、需氧性质等)，所得，所得1mL(或或1g)检样中形成菌落的总数。本标准规定的培检样中形成菌落的总数。本标准规定的培养条件下所得结果，只包括一群在平板计数琼脂上生养条件下所得结果，只包括一群在平板计数琼脂上生长发育的嗜中温需氧菌或兼性厌氧菌的
10、菌落总数。长发育的嗜中温需氧菌或兼性厌氧菌的菌落总数。GB/T 4789.2-2010 本标准与本标准与GB/T 4789.2-2008相比主要修改如下：相比主要修改如下：修改了标准的中英文名称；修改了标准的中英文名称；(食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定/食品卫生微生物学检验 菌落总数测定)修改了菌落总数计算公式中的解释；修改了菌落总数计算公式中的解释；修改了培养基和试剂；修改了培养基和试剂；删除了第二法删除了第二法 菌落总数菌落总数PetrifilmTM 测试片法。测试片法。(培养基由营养琼脂改为平板计数琼脂；培养基由营养琼脂改为平板计数琼脂；菌落总数计算公式进行了修改；菌落
11、总数计算公式进行了修改；增加了第二法“菌落总数增加了第二法“菌落总数PetrifilmTM测试片法”；测试片法”；)-2008 3.设备和材料设备和材料 3.1 恒温培养箱：恒温培养箱：361 301。3.2 冰箱：冰箱：25。3.3 恒温水浴箱：恒温水浴箱：461。3.4 天平：感量天平：感量0.1g。3.5 均质器均质器 3.6 振荡器振荡器 3.7 无菌吸管：无菌吸管：1mL（具（具0.01mL刻度）、刻度）、10mL（具（具0.1mL刻度）或微量移液器及其吸头。刻度）或微量移液器及其吸头。3.8 无菌锥形瓶：容量为无菌锥形瓶：容量为250mL、500mL。3.9 无菌培养皿：直径为无菌
12、培养皿：直径为90mm。3.10 pH计或计或pH比色管或精密比色管或精密pH试纸。试纸。3.11 放大镜或放大镜或/和菌落计数器或和菌落计数器或PetrifilmTM自自动判读仪。动判读仪。3.12 无菌刀、剪子、镊子等无菌刀、剪子、镊子等。4 培养基和试剂培养基和试剂 4.1 平板计数琼脂培养基平板计数琼脂培养基(Plate count agar PCA)，见附录见附录A中中A.1。pH 7.00.2 4.2 磷酸盐缓冲稀释液，见附录磷酸盐缓冲稀释液，见附录A中中A.2。pH 7.2 4.3 无菌生理盐水无菌生理盐水,见附录见附录A中中A.3：称取：称取8.5g氯化钠溶氯化钠溶于于1000
13、mL蒸馏水中蒸馏水中，121高压灭菌高压灭菌15min。(4.4 1 mol/L 氢氧化钠氢氧化钠（NaOH）：称取：称取40g氢氧化钠溶于氢氧化钠溶于1000mL水中水中。4.5 1 mol/L 盐酸盐酸（HCl）：移取浓盐酸：移取浓盐酸90mL，用蒸馏水稀释至用蒸馏水稀释至1000mL 4.6 PetrifilmTM菌落总数测试片菌落总数测试片（aerobic count plate）和压板和压板。)4.7 75%乙醇乙醇。区别：区别：pH值（值（08：pH 7.00.2；03：pH 7.27.4）细细 菌菌 学学 检检 验验 程程 序序-细菌总数细菌总数 5、第一法第一法 平板菌落计数法
14、平板菌落计数法 6、操作步骤、操作步骤 6.1.1 固体和半固体食品：固体和半固体食品：以无菌操作称取以无菌操作称取25g样品，放入于装有样品，放入于装有225 mL磷酸盐缓冲稀释液或磷酸盐缓冲稀释液或0.85生理盐水的无菌均质杯内，于生理盐水的无菌均质杯内，于8000r/min10000 r/min均质均质1min2min，制成，制成1:10样品匀样品匀液；或放入于液；或放入于225 mL稀释液的无菌均质袋中，用稀释液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打拍击式均质器拍打1min2min制成制成1:10的样品的样品匀液。匀液。6.1.2 液体样品：液体样品：以无菌吸管吸取样品以无菌吸管吸取样品2
15、5mL放放入装有入装有225mL磷酸盐缓冲稀释液或生理盐水的无磷酸盐缓冲稀释液或生理盐水的无菌锥形瓶菌锥形瓶(瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠)中，中，充分混匀，制成充分混匀，制成1:10的样品匀液（的样品匀液（表面取样的样表面取样的样品按一定的比例制成品按一定的比例制成1:1样品匀液和样品匀液和/或或1:10样品样品匀液。匀液。）。）。6.1 样品的稀释样品的稀释 6.1.3 用用1mL无菌吸管或微量移液器吸取无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀样品匀液液1.0 mL，沿管壁缓慢注于装有，沿管壁缓慢注于装有9mL稀释液的无菌试稀释液的无菌试管中（注意吸管尖端不要触及
16、稀释液），振摇试管或换管中（注意吸管尖端不要触及稀释液），振摇试管或换用用1支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1:100的样的样品匀液。品匀液。6.1.4 另取另取1mL无菌吸管或微量移液器吸头，按上述无菌吸管或微量移液器吸头，按上述操作顺序，做操作顺序，做10倍递增样品匀液，如此每递增稀释一次，倍递增样品匀液，如此每递增稀释一次，即换用即换用1次次1mL灭菌吸管或吸头。灭菌吸管或吸头。6.1.5 根据对样品污染情况的估计，选择根据对样品污染情况的估计，选择23个适宜个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），分别在做稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），分别在做10倍递增稀释的同时，吸取倍递增稀释的同时，吸取1.0 mL样品匀液于无菌平样品匀液于无菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。同时分别取皿内，每个稀释度做两个平皿。同时分别取1mL稀释液稀释液加入加入两个无菌平皿两个无菌平皿作空白对照。作空白对照。6.1.6 样品匀液移入平皿后，应及时将凉至样品匀液移入平皿后，应及时将凉至46平板平板计数琼脂培养基计数琼脂培养基(可放置于可放置于461恒温水
