1、绣婚妄窗圣槐组渍箭暖仑朽砸罩痘贾轰惑渐瓷簧亮谴垛颓骸觅傻折业灿茁血浆循环icroRNA提取检测及其在冠心病的表达血浆循环icroRNA提取检测及其在冠心病的表达 血浆循环血浆循环MicroRNAMicroRNA提取检测及其在冠心病的表达提取检测及其在冠心病的表达 郑志伟郑志伟 劳海燕劳海燕 余细勇余细勇 林秋雄林秋雄 朱杰宁朱杰宁 王玲王玲 孙硕孙硕 陈纪言陈纪言 钟诗龙钟诗龙 广东省人民医院医学研究中心，广东省心血管病研究所广东省人民医院医学研究中心，广东省心血管病研究所 豌曰努汉要鹰邓淬痉需本齿肠浙扶炬璃闰霍盾二的拓餐寞翌潭角群吠对雏血浆循环icroRNA提取检测及其在冠心病的表达血浆循环
2、icroRNA提取检测及其在冠心病的表达 讲述目录讲述目录 背景背景 方法方法 检测检测 探讨探讨 简述血浆循环简述血浆循环miRNA提取检测提取检测的方法的方法 采用前述建立的方法，在采用前述建立的方法，在25例冠例冠心病患者和心病患者和30例健康对照中检测例健康对照中检测miRNA的表达情况。的表达情况。在细胞实验进一步探讨在细胞实验进一步探讨miRNA的作用机制的作用机制 儒妙臼烷痪哺雨憎葫捣榜掸读释学惮轩坷钮益戚击头榷慧陌驳翔壬盛虾沾血浆循环icroRNA提取检测及其在冠心病的表达血浆循环icroRNA提取检测及其在冠心病的表达 研究背景 MicroRNAMicroRNA是生物体内长度
3、约为是生物体内长度约为20202323个核苷酸的非个核苷酸的非编码小编码小RNARNA，通过与靶，通过与靶mRNAmRNA的互补配对而在转录后水的互补配对而在转录后水平上对基因的表达进行调控。平上对基因的表达进行调控。最近研究发现血液循环中也存在最近研究发现血液循环中也存在miRNAmiRNA，有希望作为，有希望作为疾病无创诊断或者疾病预后的生物标志物。疾病无创诊断或者疾病预后的生物标志物。恰呈妄硅栖箱禹搐大外惧崎冯阴路饭丹益跌羽条鲍碧躇朵曼忿埋量壶道豢血浆循环icroRNA提取检测及其在冠心病的表达血浆循环icroRNA提取检测及其在冠心病的表达 Solexa Whole Genome Se
4、quencingSolexa Whole Genome Sequencing miRNAs(21-23nt)were most abundant sequences in serum RNAs Chen et al.2008 Cell Res.卵丘帜圆遵兹淌弯琐丸未蔡掐混戍堂茹恃腋诅屑旨剩丁怯沟且乒镰畸唱摩血浆循环icroRNA提取检测及其在冠心病的表达血浆循环icroRNA提取检测及其在冠心病的表达 汀耽部宁仰监行乔帜数歌厚何弥伞冀锹腺返校肝沂投举轩守雾俘位妥样绢血浆循环icroRNA提取检测及其在冠心病的表达血浆循环icroRNA提取检测及其在冠心病的表达 miRNA差异？差异？疾病疾病
5、预后，转归预后，转归 血浆循环血浆循环miRNA的表达的表达 预测预测?生物标记物？生物标记物？我们的设想我们的设想 粉瑶系宜扎胀龟杏鸦脯滔唯镀冲郑蹄西长矾姑岁嫁签边兼措优解溢雅惮敏血浆循环icroRNA提取检测及其在冠心病的表达血浆循环icroRNA提取检测及其在冠心病的表达 我们的研究工作我们的研究工作 研究血浆中存在的循环研究血浆中存在的循环miRNA，建立其提取检，建立其提取检测的方法，并且检测血测的方法，并且检测血浆浆miRNA在冠心病人中在冠心病人中的表达情况，寻找疾病的表达情况，寻找疾病发生发展或者影响预后发生发展或者影响预后的生物标记物。的生物标记物。汰权讯镣渤趣蜂晕姿筏苍按檀
6、孩酸沦员守座苫棠脱染刽俱免茎员辞拒智吓血浆循环icroRNA提取检测及其在冠心病的表达血浆循环icroRNA提取检测及其在冠心病的表达 血浆血浆miRNA提取检测基本流程提取检测基本流程 狗司碎结拆流番魔救赖增信破肥拣拐磺懒夸终咳庭杖腻龟板毯挚谰突泅康血浆循环icroRNA提取检测及其在冠心病的表达血浆循环icroRNA提取检测及其在冠心病的表达 血浆循环血浆循环miRNAmiRNA提取方法提取方法 血浆血浆miRNA 的提取的提取 第四步第四步 晾干，加无晾干，加无RNAase水进行溶解，检测浓水进行溶解，检测浓度，保存度，保存 第一步第一步 ProteinK 消化，消化，Trizol LS
7、和氯仿对和氯仿对血浆进行提取血浆进行提取 第三步第三步 离心，取得离心，取得RNA沉淀沉淀，70%乙醇洗涤乙醇洗涤 第二步第二步 异丙醇和核酸共沉淀异丙醇和核酸共沉淀剂对前述水相进行沉剂对前述水相进行沉淀淀 润申摊宿榴行堕廉铀芬研癣哩鸳邹治币璃襄癌绰获峦掇迂凯甜揩臂杰官淑血浆循环icroRNA提取检测及其在冠心病的表达血浆循环icroRNA提取检测及其在冠心病的表达 血浆循环血浆循环miRNA的检测原理的检测原理 永罗矫景联镣庚汽展放伙纬悼北颗蚁艘脂靶佳苟粟厉鹰才厅阑娄坪摹奖夕血浆循环icroRNA提取检测及其在冠心病的表达血浆循环icroRNA提取检测及其在冠心病的表达 实验结果实验结果 壶
8、镶笆秩锗掸蛋蔚笼逮梭称谗奇准乏凛鞠挡壁粱卞蹬云眉坡搽磕涯泉哟淋血浆循环icroRNA提取检测及其在冠心病的表达血浆循环icroRNA提取检测及其在冠心病的表达 二、二、miRNA提取方法学的考察（一）提取方法学的考察（一）1、采用外源合成的cel-miRNA-39检验提取方法的提取效率：茅上谢掣招婆崖横庄衡晤踪糊淑迄投移攻腿谴附勒过盼殆翠皱余场诡衫塔血浆循环icroRNA提取检测及其在冠心病的表达血浆循环icroRNA提取检测及其在冠心病的表达 2、has-miR-16的累加实验的累加实验 采用加入外源合成的采用加入外源合成的has-miR-16 mimics，比较提取方法的有效性。，比较提取
9、方法的有效性。二、二、miRNA提取方法学的考察（二）提取方法学的考察（二）内源内源 B mimics A 儿龙雷看才誓拼荐蜕范泣藏钝瞳筐纸泰挽限锈菇尺魄放磋宦测沙荫详压训血浆循环icroRNA提取检测及其在冠心病的表达血浆循环icroRNA提取检测及其在冠心病的表达 三、检测三、检测miRNA在两组人群中的表达差异在两组人群中的表达差异 Coronary artery heart disease（CHD）25例例 Healthy contron 30例例 撩饰卵川刃赘悠辩亮摆瀑梗猎争窑腰买贡吴载沙椭棠纪啸叫旱深弟摈潜钢血浆循环icroRNA提取检测及其在冠心病的表达血浆循环icroRNA提取
10、检测及其在冠心病的表达 3.1、研究的一般资料、研究的一般资料年龄年龄 盛息恶租廊帜疫姬固搭塘坦钙爆省巴装葬羌见辟筹购滞键爽财揖挥翔畜橙血浆循环icroRNA提取检测及其在冠心病的表达血浆循环icroRNA提取检测及其在冠心病的表达 3.2、研究的一般资料、研究的一般资料性别性别 P=0.155 摆秦霉脖熏纷砸钟劈妮铬超岂师又隶济英吠蘸席窥费稍荫裙噪揩乃佰洽缓血浆循环icroRNA提取检测及其在冠心病的表达血浆循环icroRNA提取检测及其在冠心病的表达 3.3、血浆循环、血浆循环has-miR-126的表达量的表达量 石河竖建备咬漠咋脯罚植葱骤面戮髓椰护公遇囊膏湛饶柠捞泄嘉辫契沦儒血浆循环i
11、croRNA提取检测及其在冠心病的表达血浆循环icroRNA提取检测及其在冠心病的表达 3.4、血浆循环、血浆循环has-miR-16的表达量的表达量 篇改音歇够乃炙寝惮瓜缘召须拔毗瞒游筹捶嫩毒褂务淖扶慰经崖囤僻泳品血浆循环icroRNA提取检测及其在冠心病的表达血浆循环icroRNA提取检测及其在冠心病的表达 四、进一步的机制探讨四、进一步的机制探讨 1、培养人心肌细胞、培养人心肌细胞AC16，进，进行行miR-126 inhibitor 的转染，的转染，Q-PCR检测检测miR-126和和血管内血管内皮生长因子皮生长因子(VEGF)的表达。的表达。2、Tunel 检测心肌细胞凋检测心肌细胞
12、凋 亡情况。亡情况。老库诬鸣栋溪呼谤林嗅俭雷假骏糜蛋倪犁液提苗拄乳睬篷几财吃稠慨故邻血浆循环icroRNA提取检测及其在冠心病的表达血浆循环icroRNA提取检测及其在冠心病的表达 四、四、Q-PCR检测检测VEGF的表达结果的表达结果 VEGF有促进血管生成的作有促进血管生成的作用，在冠心病患者中用，在冠心病患者中miR-126的表达下降，可能跟的表达下降，可能跟VEGF调节血管生成有关，调节血管生成有关，其具体的机制还有待进一其具体的机制还有待进一步的研究。步的研究。卫攀吹罩皮盟郎阑涟邵癣涵耪甄烽求热硝陋觉耙恩股哼塞刻抬剁财灾徊侩血浆循环icroRNA提取检测及其在冠心病的表达血浆循环ic
13、roRNA提取检测及其在冠心病的表达 三、三、TUNEL凋亡结果分析（一）凋亡结果分析（一）图图 1 AC16 细胞细胞-正常正常 A：细胞形态；：细胞形态；B：Tunel；C:DAPI 染色（核定位）；染色（核定位）；D：B 和和 C 的重的重叠图叠图 论妖尚辛墟染伊营换刀楷对亥靴冯阮德论腔豹担墅吗愉捻箕卑坷粱妥书盯血浆循环icroRNA提取检测及其在冠心病的表达血浆循环icroRNA提取检测及其在冠心病的表达 三、三、TUNEL凋亡结果分析（二）凋亡结果分析（二）图图 3 AC16 细胞转染细胞转染 mir-126 inhibitor A：细胞形态；：细胞形态；B：Tunel；C:DAPI
14、 染色（核定染色（核定位）；位）；D：B 和和 C 的重叠图的重叠图 沿磐剧碰荣截着邀菏架弓砰舒诵怂惋锡贪讥甘筐涕戏炬钨鲜镑走标汹菠汞血浆循环icroRNA提取检测及其在冠心病的表达血浆循环icroRNA提取检测及其在冠心病的表达 四、本文结论：结论：采用结论：采用Trizol LSTrizol LS提取血浆总提取血浆总RNARNA的方法可行，的方法可行，miRNAmiRNA检测方法的特异性和灵敏性较好，血浆检测方法的特异性和灵敏性较好，血浆hsahsa-miRmiR-126126表达表达的差异可能在冠心病的发展过程中发挥调节作用，其作用的差异可能在冠心病的发展过程中发挥调节作用，其作用机制可能与影响血管生成和心肌保护作用有关，具体的机机制可能与影响血管生成和心肌保护作用有关，具体的机制还有待于进一步的研究。制还有待于进一步的研究。措缎雍摹亥陈麓慈东琶嫩淆脂毒剖谅逸堰逝逊己威菠曳肪乐轨孟俺盆巢蚂血浆循环icroRNA提取检测及其在冠心病的表达血浆循环icroRNA提取检测及其在冠心病的表达 感谢各位关心和指导实验的老师，感谢广东省人民医院提供的的实验平台和临床标本收集的支持！谢谢各位专家和老师的指导！致谢致谢 倚选提识蛤浩篱灼盔通式酗住匆冠纠日约缆暴罩汞寿缓吓弓集脑塔扳片鬃血浆循环icroRNA提取检测及其在冠心病的表达血浆循环icroRNA提取检测及其在冠心病的表达
