1、基础研究L n c R N AL I N C 0 0 6 6 3对胶质瘤细胞增殖及凋亡的影响时景仁,郭晶晶,王 爽,王雅杰(首都医科大学附属北京地坛医院检验科,北京1 0 0 0 1 5)D O I:1 0.1 1 7 4 8/b j m y.i s s n.1 0 0 6-1 7 0 3.2 0 2 2.1 1.0 2 4收稿日期:2 0 2 2-0 1-0 2;修回日期:2 0 2 2-0 1-2 5基金项目:国家自然科学基金(编号:8 1 5 7 2 4 7 4)通讯作者:王雅杰,首都医科大学附属北京地坛医院检验科,教授。摘要:目的 探讨长链非编码R NA(L n c R NA)-L I
2、 N C 0 0 6 6 3对胶质瘤细胞增殖和凋亡的影响,并探讨其可能机制。方法实时荧光定量P C R检测人脐静脉内皮细胞(HUV E C)和胶质瘤细胞系A 1 7 2中L I N C 0 0 6 6 3的表达水平。用s i R NA沉默A 1 7 2细胞中L I N C 0 0 6 6 3的表达,分为s i R NA-N C组和s i R NA-L I N C组,采用C C K-8法和E DU法检测细胞增殖,流式细胞术A n n e x i n V-F I T C/7-AA D双染法 检 测 细 胞 凋 亡 率,W e s t e r nb l o t检 测 凋 亡 相 关 蛋 白B a x
3、和B c l-2的 表 达 水 平,W e s t e r nb l o t检测细胞内Wn t 3 a表达水平。结果 A 1 7 2细胞中L I N C 0 0 6 6 3的表达水平明显高于HUV E C(P0.0 1)。与s i R NA-N C组相比,s i R NA-L I N C组细胞增殖能力降低,凋亡率增加,W n t 3 a表达水平降低,差异具有统计学意义(P0.0 5)。结论 L I N C 0 0 6 6 3可能通过调控Wn t 3 a表达影响A 1 7 2细胞的增殖和凋亡。关键词:胶质瘤;L I N C 0 0 6 6 3;增殖;凋亡;Wn t 3 a中图分类号:R 7 3
4、9.4 1 文献标识码:AE f f e c t so fL n c R N AL I N C 0 0 6 6 3o nP r o l i f e r a t i o na n dA p o p t o s i so fH u m a nG l i o m aC e l l sS H I J i ngr e n,GUOJ i ng ji ng,WANGS h u a ng,WANG Y aji e(B e iji ngD i t a nH o spi t a l,C api t a lM e d i c a lU n i v e r s i ty,B e iji ng1 0 0 0 1 5,C
5、 h i n a)A b s t r a c t:O b j e c t i v e T o i n v e s t iga t et h e e f f e c t s o fl o ngn o n-c o d i ngR N A(L n c R N A)-L I N C 0 0 6 6 3 o npr o l i f e r a t i o na n dapopt o s i s i nh u m a ngl i o m a c e l l l i n eA 1 7 2a n d t h eu n d e r lyi ngm o l e c u l a rm e c h a n i s m
6、.M e t h o d sT h ee xpr e s s i o no fL I N C 0 0 6 6 3 i nh u m a nu m b i l i c a l v e i ne n d o t h e l i a l c e l l l i n eHUV E Ca n dh u m a ngl i o m ac e l ll i n eA 1 7 2w a s d e t e r m i n e dbyr e a l-t i m e f l u o r e s c e n c equ a n t i t a t i v eP C R.T h e e xpr e s s i o n
7、o fL I N C 0 0 6 6 3 i nA 1 7 2c e l l sw a s s i l e n c e dbys i R N A,t h e nc e l l sw e r ed i v i d e d i nt h e s i R N A-N Cgr o upa n ds i R N A-L I N Cgr o up.C e l lc o u n t i ngK i t-8a n dE d U a s s ayw e r ea d opt e df o rt h ea n a lys i so fc e l lpr o l i f e r a t i o n.C e l la
8、popt o s i sw e r ee v a l u a t e dbyf l o wcyt o m e t ry.T h e e xpr e s s i o n l e v e l s o fB A X,B C L-2,a n dW n t 3 aw e r ed e t e r m i n e dbyw e s t e r nb l o t t i ng.R e s u l t sT h ee xpr e s s i o nl e v e lo fL I N C 0 0 6 6 3i n A 1 7 2c e l l sw a ss ign i f i c a n t lyh igh
9、e rt h a nt h a ti nHUV E C(P0.0 1).C o mpa r e dw i t ht h es i R N A-N Cgr o up,t h ee xpr e s s i o nl e v e lo fL I N C 0 0 6 6 3,t h ec e l lpr o l i f e r a t i o na b i l i ty,a n d t h e e xpr e s s i o n l e v e l o fW n t 3 a i n t h e s i R N A-L I N Cgr o upw e r ed e c r e a s e d,w h i
10、 l e t h eapopt o t i c r a t eo f c e l l s i n c r e a s e ds ign i f i c a n t ly(P0.0 5).C o n c l u s i o nL I N C 0 0 6 6 3m aya f f e c t t h epr o l i f e r a t i o na n dapopt o s i s o fA 1 7 2c e l l sbyr egu l a t i ngt h ee xpr e s s i o no fW n t 3 a.K e yw o r d s:G l i o m a;L I N C
11、0 0 6 6 3;P r o l i f e r a t i o n;Apopt o s i s;Wn t 3 a6191L a b e l e dI mm u n o a s s a y s&C l i nM e d,N o v.2 0 2 2,V o l.2 9,N o.1 1 脑胶质瘤是成人最常见的原发性颅内恶性肿瘤,其中恶性程度最高的胶质母细胞瘤约占一半。最新的统计数据表明,即使经过积极治疗,胶质母细胞瘤 中 位 生 存 期 也 仅8个 月,5年 生 存 率 仅 为7.2%1。因此,探索胶质瘤准确的分子机制和可靠的治疗靶点至关重要。L n c R NA s由各种大小超过2 0 0个核
12、苷酸(n t)的R NA转录本组成,缺乏显著的蛋白质编码能力2。研究发现,多种L n c R NA s在胶质瘤中异常表达,并通过影响肿瘤细胞增殖、凋亡、侵袭和转移等生物过程参与胶质瘤的发生发展3-6。L I N C 0 0 6 6 3是基因间长链非编码R NA(又称L O C 2 8 4 4 4 0),定位于人1 9 p 1 3.1 1染色体上。既往关于L I N C 0 0 6 6 3在肿瘤中的研究较少,有一项研究7表明,L I N C 0 0 6 6 3在多种癌细胞系中异常表达,提示L I N C 0 0 6 6 3可能在癌症发病机制中发挥作用。本课题组前期研究发现,L I N C 0 0
13、 6 6 3在胶质瘤组织中表达增加,下调L I N C 0 0 6 6 3表达可抑制胶质瘤细胞的 增 殖、迁 移 和 侵 袭 能 力,并 初 步 论 证 了L I N C 0 0 6 6 3可能参与AK T/mTO R通路转录后调控8,但是具体分子机制仍有待探索。因此,本研究拟进一步研究L I N C 0 0 6 6 3在胶质瘤细胞中的作用及其分子机制。材料和方法 1 材料 人胶质母细胞瘤细胞系A 1 7 2和脐静脉内皮细胞系HUV E C购自中国医学科学院北京协和细胞资源中心;DMEM高糖培 养基、胎牛血 清 购 自 美 国G i b c o公司;0.2 5%胰蛋白酶购自美国H y c l
14、o n e公司;L n c R N A-L I N C 0 0 6 6 3特异性s i R N A由上海吉玛基因设计合成;L I N C 0 0 6 6 3和G A P D H引物均由上海生工生物工程有限公司设计合成;j e t P R I M E转染试剂购自法国P o l y p u s公司;C C K-8检测试剂盒购自日本同仁化学研究所;E d U细胞增殖检测试剂盒购自广州锐博生物技术有限公司;c D N A反转录试剂盒、S Y B RG R E E N购自日本T a K a R a公司;F I T CA n n e x i nV凋亡检测试剂盒购自美国B D公司;R I P A蛋白裂解液和
15、B C A蛋白定量试剂盒购自美国T h e r m oS c i e n t i f i c公司;S D S-P A G E及W e s t e r nb l o t相关试剂购自美国I n v i t r o g e n公司;兔抗B a x多克隆抗体、兔抗B c l-2单克隆抗体购自C S T公司;兔抗W n t 3 a多克隆抗体购自A b c a m公司;E C L超敏发光剂购自美国T h e r m oS c i e n t i f i c公司。2 方法 2.1 细胞培养 用含1 0%胎牛血清的DMEM高糖 培 养 基 在5%C O23 7恒 温 培 养 箱 中 培 养A 1 7 2细胞和
16、HUV E C细胞(实验中所用细胞均为复苏后第二代细胞)。2.2 实时荧光定量P C R检测L I N C 0 0 6 6 3的表达 收集A 1 7 2和HUV E C细胞,用T r i z o l法提取细胞总R NA。去除基因组D NA后,将R NA反转录为c D NA,再以c D NA作为模板,根据合成的P C R引物(L I N C 0 0 6 6 3上 游:5-G C T T G T AG C C C CT T T C T T T T G G-3,下 游:5-AG T C C C T T CT G CC T AT GAC C C T-3;GA P DH上游:5-G C AC C GT C A AG GC T G AGA A C-3,下游:5-T G GT GAAGAC G CC AGT G G A-3)进行扩增。采用2-C t法计算差异表达量。实验重复3次。2.3 细胞转染与实验分组 将处于对数生长期的A 1 7 2细胞接种于6孔板,待细胞汇合度达到6 0%7 0%时,参照j e t P R I ME转染试剂说明书分别将s i R NA-L I N C 0 0 6 6 3(共
