1、中 国 组 织 化 学 与 细 胞 化 学 杂 志CHINESE JOURNAL OF HISTOCHEMISTRY AND CYTOCHEMISTRY第 31 卷第 6 期2022 年 12 月Vol.31.No.6December.2022收稿日期2022-04-23 修回日期2022-12-04基金项目2019 年四川省卫生健康委员会科研课题 19PJ070作者简介杨俊，男（1985 年），汉族，学士学位，主治医师*通讯作者(To whom correspondence should be addressed)：miR-140 抑制卵巢癌细胞增殖促进卵巢癌细胞凋亡及靶向抑制 CMTM6
2、表达杨俊1，祝徳1，段智慧1，张子月2*（1巴中市中心医院，巴中 636000；2西部战区总医院老年科，四川 610036）摘要目的 探讨 miR-140 能否通过调控趋化素样因子超家族 6（CMTM6）表达对卵巢癌细胞增殖、凋亡及程序性死亡配体 1（PD-L1）表达产生影响。方法 将人源 SKOV3 卵巢癌细胞分为：对照组、inhibitor-NC 组、miR-140 inhibitor 组、mimic-NC 组、miR-140 mimic 组、miR-140mimic+pcDNA3.0-CMTM6 组。MTT 法、EdU 染色和流式细胞仪、TUNEL 染色分别检测细胞增殖和凋亡的发生情况。
3、采用实时荧光定量 PCR（qRT-PCR）检测 CMTM6、PD-L1 mRNA 表达水平。Western blot 检测细胞 CMTM6、PD-L1、增殖与凋亡相关蛋白表达水平。双荧光素酶报告基因实验验证 CMTM6 与 miR-140 的靶向关系。结果 与对照组相比，下调 miR-140 表达可增加 SKOV3 细胞存活率和 EdU 阳性率，上调 c-Myc、cyclin D1、Bcl-2、CMTM6、PD-L1 表达水平，抑制细胞凋亡和 Bax、Caspase-3 表达水平，而 miR-140 过表达可抑制 SKOV3 细胞存活率和 EdU阳性率，下调 c-Myc、cyclin D1、B
4、cl-2、CMTM6、PD-L1 表达水平，促进细胞凋亡和 Bax、Caspase-3 表达；CMTM6 过表达可逆转 miR-140 过表达对 SKOV3 细胞增殖的抑制、对凋亡的促进和对 PD-L1 表达的抑制。双荧光素酶报告基因实验结果显示，CMTM6 是 miR-140 的靶基因。结论 miR-140 可能通过下调 CMTM6 表达抑制卵巢癌细胞的增殖、促进卵巢癌细胞凋亡。关键词miR-140；趋化素样因子超家族 6；卵巢癌；程序性死亡受体-配体 1中图分类号R737.31 文献标识码A DOI：10.16705/ki.1004-1850.2022.06.007Inhibition o
5、f proliferation,promotion of apoptosis,and target inhibition of CMTM6 expression by miR-140 in ovarian cancer cellsYang Jun1,Zhu De1,Duan Zhihui1,Zhang Ziyue2*(1Bazhong Central Hospital Sichuan,Bazhong 636000;2Department of Gerontology,General Hospital of Western Warzone,Sichuan 610036)AbstractObjec
6、tive To investigate whether miR-140 could affect the proliferation,apoptosis and programmed death ligand 1(PD-L1)expression in ovarian cancer cells by regulating the expression of chemokine like factor superfamily 6(CMTM6).Methods Human SKOV3 ovarian cancer cells were divided into blank control grou
7、p,inhibitor-NC group,miR-140 inhibitor group,mimic-NC group,miR-140 mimic group,and miR-140mimicn+pcDNA3.0-CMTM6 group.MTT method,EdU staining,flow cytometry and TUNEL staining were used to detect the occurrence of cell proliferation and apoptosis,respectively.Real-time fluorescence quantitative PCR
8、(qRT-PCR)was used to detect the mRNA expression levels of CMTM6 and PD-L1.Western blot was used to detect the expression levels of CMTM6,PD-L1,proliferation and apoptosis related proteins.The dual luciferase reporter gene experiment verified the tar-geting relationship between CMTM6 and miR-140.Resu
9、lts Compared with the control group,down-regulation of miR-140 expression could promote SKOV3 cell survival and EdU positive rate,up-regulating expression levels of c-Myc,cyclin D1,Bcl-2,CMTM6,PD-L1,inhibiting cell apoptosis,Bax,Caspase-3 expression levels,while overexpression of miR-140 can inhibit
10、 SKOV3 cell survival rate and EdU positive rate,down-regulating expression levels of c-Myc,cyclin D1,Bcl-2,CMTM6,PD-L1,and promoting cell apoptosis and levels of Bax and Caspase-3.Overexpression of CMTM6 could reverse the inhibition of proliferation and promotion of apoptosis of SKOV3 cells and expr
11、ession inhibition of CMTM6 by overexpression of miR-140.The results of the dual luciferase reporter gene experiment showed that CMTM6 is the target gene of miR-140.Conclusion Overexpression of miR-140 may inhibit the proliferation 杨俊等.miR-140 抑制卵巢癌细胞增殖促进卵巢癌细胞凋亡及靶向抑制 CMTM6 表达第 6 期 583卵巢癌是女性生殖器官中常见的三大
12、恶性肿瘤之一，每年因卵巢癌病死的妇女就有 14 万1,2。因此迫切需要寻找针对卵巢癌相关早期诊断方法，为卵巢癌的早期诊断提供相应的理论依据。MicroRNA是真核生物中一类小分子非编码 RNA，在细胞的增殖、分化、凋亡和肿瘤发生发展过程中起着重要的作用3-5。有研究报道，miR-140 在胆管癌6、胰腺癌7、乳腺癌8等多种肿瘤中起着重要的作用。然而，miR-140在卵巢癌中的表达模式及对卵巢癌细胞增殖和凋亡的影响，尚不清楚。趋化素样因子超家族6（chemokine-like factor superfamily 6，CMTM6）广泛存在于人体正常组织中，主要存在于细胞膜上和参与胞内物质循环的胞
13、内体上9。Guan10等通过分析TCGA数据库和全基因组分析发现，CMTM6能够调控 T 细胞进行肿瘤细胞的杀伤，提示 CMTM6 可能促进肿瘤的发生发展，但具体机制尚不清楚。有研究发现，程序性死亡受体-配体1（programmed death receptor ligand 1，PD-L1）在人三阴性乳腺癌11细胞中高表达。进一步有研究表明，CMTM6与PD-L1表达呈正相关，共同调控着肿瘤的发生发展12。目前关于 miR-140 是否可能通过调控 CMTM6 表达影响卵巢癌进展尚不清楚，因此，本研究将探究miR-140是否调控 CMTM6 及 PD-L1 的表达及其与卵巢癌细胞增殖、凋亡的
14、关系，为明确 miR-140 在卵巢癌中发挥的作用提供线索。材料与方法1 试剂与仪器设备人 源 卵 巢 癌 细 胞 株 SKOV3（货 号：40384840451）购自中科院上海细胞库。RPMI-1640培 养 基（货 号：SH30809.01）、胎 牛 血 清（货号：SH30080.03）、0.25%的胰酶消化液（货号：SH30042.01）均购自美国 Gibco 公司；BCA 蛋白检测试剂盒（货号：23250）、MTT 检测试剂盒（货号：4890-025-K）购自上海嵘崴达实业有限公司；Annexin V-FITC/PI 细胞凋亡检测试剂盒（货号：556547）购自美国BD公司；EdU细胞
15、增殖检测试剂盒（货号：CA1170）购自北京索莱宝科技有限公司；TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒（货号：KGA7037-1）购自上海圻明生物科技有限公司；双荧光素酶报告基因检测试剂盒（货号：KA3784）购自上海群己生物科技有限公司；脂质体 LipofectamineTM2000（货号：11668027）购自美国 Invitrogen；对照 miR-140 inhibitor（Inhibitor NC）、miR-140 inhibitors（Inhib-itor）、对照 miR-140 mimic（Mimic NC）、miR-140 mimics（Mimic）、pcDNA3.0-CMTM6 质
16、粒 由 生工生物有限公司合成。PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser Kit（Perfect Real Time）（货号：RR047AA）、SYBR Premix Ex TaqTM（Tli RNaseH Plus）（货号：RR820A）购自日本 TAKARA 公司；兔抗人CMTM6（货号：Ab198284）购于英国Abcam公司，兔抗人 PD-L1（货号：#15165）购于美国 Cell Signaling 公司；兔抗人 c-Myc（货号：MAB3696）、兔抗人 cyclin D1（货号：MAB4314）、鼠抗人 Bcl-2（货号：AF810）、鼠抗人 Bax（货号：AF820）、鼠抗人 Caspase-3（货号：AF835）购于美国 R&D；GAPDH 抗体和辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗购自美国 Santa Cruz 公司；FACSCanto II 流式细胞仪购自美国 BD 公司；二氧化碳恒温细胞培养箱购自美国 SHEL-LAB 公司；酶联免疫标记分析仪购自芬兰雷勃 Multiskan MK-3；倒置显微镜购自日本OLYMP
