1、基础研究Nrf2/HO-1和 Smad 通路在 HII 介导肝纤维化早期形成的作用杨洋宋千黛赵婧瑶仝琳鸽叶圣莹秦燕(大理大学基础医学院生理与病理生理学教研室，云南大理671000)摘要 目的通过建立肝缺血再灌注损伤介导肝纤维化小鼠模型，探讨核因子 E2 相关因子(Nrf)2/HO-1 和 Smad通路在肝纤维化早期形成过程中的作用，进一步阐明肝纤维化早期启动的机制。方法将 24 只 C57 雄性小鼠分为正常对照组和模型(0、3、6 h)组，每组 6 只。模型组用血管夹夹闭肝门静脉、入肝中叶和左叶的肝动脉 90 min，开夹后再灌注 0、3 及6 h。检测血浆丙氨酸氨基转移酶(ALT)、乳酸脱氢
2、酶(LDH)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)含量;测定肝组织超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)含量;反转录-聚合酶链反应(T-PC)检测肝组织白细胞介素(IL)-6、IL-1、肿瘤坏死因子(TNF)-、-平滑肌肌动蛋白(SMA)、血红素加氧酶(HO)-1、Nrf2、转化生长因子(TGF)-1 含量;Western 印迹检测肝组织-SMA、TGF-1、Smad3、Smad7 的蛋白表达量;苏木素-伊红(HE)染色观察肝组织形态学变化。结果与对照组相比，模型组各组血浆ALT、LDH 水平明显升高(P0.05);血浆 GSH-Px 水平明显降低(P0.05);肝组织 SOD 含量明显降低
3、(P0.05)，而 MDA 含量明显升高(P0.05);肝组织 IL-6、IL-1b、TNF-、TGF-1、-SMA mNA 的表达量均呈不同程度明显增加(P0.05)，HO-1、Nrf2mNA 的表达量则呈不同程度明显降低(P0.05);肝组织 TGF-1、-SMA、Smad3、Smad7 的蛋白表达量呈不同程度明显增加(P0.05)。HE 染色显示，模型组各组肝细胞均有不同程度水肿、脂肪变性、局灶性坏死。结论缺血再灌注损伤介导的早期肝纤维化与 Nrf2/HO-1 和 Smad 通路激活都有关，但 Smad 通路的激活在早期启动中可能不起主要作用。关键词 肝缺血再灌注损伤;肝纤维化;Nrf2
4、/HO-1 通路;Smad 通路中图分类号 575 文献标识码 A 文章编号 1005-9202(2023)03-0598-05;doi:10.3969/j.issn.1005-9202.2023.03.025基金项目:国家自然科学基金(81660111);大理大学创新团队(ZKLX2020306)通信作者:秦燕(1973-)，女，硕士，教授，硕士生导师，主要从事消化生理与病理研究。第一作者:杨洋(1994-)，女，硕士在读，主要从事消化生理与病理研究。ole of Nrf2/HO-1 and Smad pathway in the early formation of hepaticfibr
5、osis mediated by HIIYANG Yang，SONG Qian-Dai，ZHAO Jing-Yao，et alDepartment of Physiology and Pathophysiology，School of Basic Medicine，Dali University，Dali 671000，Yunnan，China【Abstract】ObjectiveTo explore the role of nuclear factor E2 related factor(Nrf)2/HO-1 and Smad pathway in the early for-mation
6、of hepatic fibrosis by establishing a mouse model of hepatic ischemia-reperfusion injury，and further clarify the mechanism ofearly initiation of hepatic fibrosis MethodsTwenty-four C57 male mice were divided into normal control group and model(0，3 and6 h)groups，with 6 mice in each group In the model
7、 group，the hepatic portal vein，hepatic artery entering the middle and left lobeof the liver were clamped by vascular clamp for 90 minutes，and then reperfused for 0，3 and 6 hours after opening the clip Plasma al-anine aminotransferase(ALT)，lactic dehydrogenase(LDH)and glutathion peroxidase(GSH-Px)wer
8、e detected The contents of super-oxide dismutase(SOD)and malondialdehyde(MDA)in liver tissue were measured everse transcription-polymerase chain reaction(T-PC)was used to detect the contents of interleukin(IL)-6，IL-1，tumor necrosis factor(TNF)-，-smooth muscle actin(-SMA)，haem oxygenase(HO)-1，Nrf2 an
9、d transforming growth factor(TGF)-in liver tissue The expression of-SMA，TGF-1，Smad3 and Smad7 in liver tissue were detected by Western blot The morphological changes of liver tissue were observed by htoxylin e-osin(HE)staining esultsCompared with control group，plasma ALT and LDH levels in model grou
10、ps were significantly increased(P005)，plasma GSH-Px level was significantly decreased(P0 05)，SOD content in liver tissue was significantly decreased(P0 05)，while MDA content was significantly increased(P0 05)，the expressions of IL-6，IL-1，TNF-，TGF-1 and-SMA m-NA in liver tissue were significantly inc
11、reased in different degrees(P0 05)，while the expressions of HO-1 and Nrf2 mNA were sig-nificantly decreased in different degrees(P005)，the expressions of TGF-1，-SMA，Smad3 and Smad7 in liver tissue were signif-icantly increased in different degrees(P005)HE staining showed that liver cells in model gr
12、oups had edema，steatosis and focal895中国老年学杂志 2023 年 2 月第 43 卷necrosis in different degrees ConclusionsThe early hepatic fibrosis mediated by ischemia-reperfusion injury is related to the activa-tion of Nrf2/HO-1 and Smad pathway，but the activation of Smad pathway may not play a major role in the ear
13、ly initiation【Key words】Liver ischemia-reperfusion injury;Liver fibrosis;Nrf2/HO-1 pathway;Smad pathway肝纤维化是各种慢性肝病的共同病理过程，是肝硬化的必经阶段。肝纤维化可以逆转，而肝硬化不可逆，因此逆转、延缓甚至阻断肝纤维化是临床研究的热点1，2。肝缺血再灌注损伤(HII)常见于休克、肝外科手术等，其发生与氧化应激反应、细胞因子释放、炎性细胞浸润等密切相关，而这些因素又可以激活肝星状细胞(HSC)，启动肝纤维化3，4。可见 HII 与肝纤维化密切相关，利用 HII 诱导肝纤维化符合疾病的自然
14、进程。肝缺血后从再灌注开始到 6 h 内的急性损伤阶段5，6，主要表现为 Kuffer 细胞激活，释放活性氧簇(OS)和炎性细胞因子如肿瘤坏死因子(TNF)-、白细胞介素(IL)-1 等，共同介导肝脏的氧化应激损伤。核因子 E2 相关因子(Nrf)2 是维持氧化还原稳态的主要细胞调节因子，是保护器官免受氧化应激损伤的胞内信号相关的重要转录因子7，8，在 OS刺激下 Nrf2 引起抗氧化反应元件调节基因的转录激活，调控相代谢酶、抗氧化酶等，发挥抗氧化作用。血红素加氧酶(HO)-1 是 Nrf2 下游的抗氧化酶，具有抗氧化、改善组织微循环等作用。已证明Nrf2/HO-1 通路激活对 HII 具有保
15、护作用9。转化生长因子(TGF)-Smad 通路是促肝纤维化形成的最重要的信号通路。本研究基于 Nrf2/HO-1 和Smad 通路探讨 HII 介导肝纤维化早期启动的初步机制，为进一步完善肝纤维化机制提供一定依据。1材料与方法1.1材料C57 雄性小鼠，体重 20 25 g，SPF 级，购自昆明医科大学实验动物中心。药物与试剂:丙氨酸氨基转移酶(ALT)、乳酸脱氢酶(LDH)、谷胱甘肽 过 氧 化 物 酶(GSH-Px)、超 氧 化 物 歧 化 酶(SOD)、丙二醛(MDA)试剂盒均购于南京建成生物工程研究所;-平滑肌肌动蛋白(-SMA)、TGF-1单克隆抗体购于 Abcam 公司;辣根过氧
16、化物酶(HP)标记的抗兔免疫球蛋白(Ig)G 购于北京中杉生物技术有限公司;其他试剂均为分析纯。1.2主要仪器奥地利安图 2010 酶标仪(奥地利安图斯公司);ABIStepOnePlusPC 扩增仪(美国应用生物系统公司);T6 紫外分光光度计(北京普析);组织研磨器(北京诺博莱德科技有限公司);免疫印迹电泳系统(美国 Bio-ad)。1.3动物分组及模型制备将24 只 C57 雄性小鼠分为正常对照组(n=6)和模型组(n=18)。其中模型组根据再灌注后 0 h、3 h、6 h，分为模型组 0、3 及6 h 组。模型组用动脉夹夹闭肝门静脉、入肝中叶和左叶的肝动脉 90 min，开夹后，分别再灌注 0 h、3 h和 6 h。1.4指标检测及方法检测血浆中 ALT、LDH 和GSH-Px 含量;测定肝组织 SOD、MDA 含量;反转录-聚合酶链反应(T-PC)检测肝组织中 IL-6、IL-1b、TNF-、-SMA、HO-1、Nrf2 和 TGF-1 含量;Western印迹检测肝组织-SMA、TGF-1、Smad3、Smad7 的蛋白表达量;苏木素-伊红(HE)染色观察肝组织形态学变化。
