1、 172 Chin J Mod Appl Pharm,2023 January,Vol.40 No.2 中国现代应用药学 2023 年 1 月第 40 卷第 2 期 WBSCR22 基因调控人恶性肿瘤细胞铁死亡的研究 屠凌岚，颜冬梅*(杭州医学院检验医学院、生物工程学院，杭州 310013)摘要：目的 研究 WBSCR22 是否参与调控细胞铁死亡。方法 设计合成靶向人 WBSCR22 基因的 siRNA(siWBSCR22)，瞬时转染敲低 WBSCR22 mRNA；RT-qPCR、Western blotting 分别检测 WBSCR22 mRNA、蛋白表达水平；铁死亡诱导剂Erastin、R
2、SL3 单独或联合抗氧化剂 NAC、坏死抑制剂 NSA、凋亡抑制剂 ZVAD-FMK、自噬抑制剂 3-MA 作用于人结直肠癌细胞系 HCT116 和 RKO、人肺癌细胞系 H460、人肝癌细胞系 SMMC7721，CCK8 法检测细胞死亡率；丙二醛法、菲罗嗪法分别检测细胞脂质过氧化水平、Fe2+浓度。结果 siWBSCR22 瞬时转染显著降低 WBSCR22 mRNA 及蛋白水平；WBSCR22 敲低显著促进 Erastin、RSL3 诱导的 HCT116、RKO、H460、SMMC7721 细胞铁死亡；加入 NAC 后显著降低Erastin、RSL3 诱导的 WBSCR22 敲低细胞铁死亡，
3、而加入 NSA、ZVAD-FMK、3-MA 对 Erastin、RSL3 诱导的 WBSCR22敲低细胞铁死亡无影响；Erastin、RSL3 诱导后细胞内的 Fe2+浓度无明显变化，脂质过氧化水平显著增加。结论 WBSCR22基因参与调控肿瘤细胞铁死亡。关键词：WBSCR22；铁死亡；肿瘤细胞；脂质过氧化；Fe2+中图分类号：R966 文献标志码：A 文章编号：1007-7693(2023)02-0172-07 DOI:10.13748/ki.issn1007-7693.2023.02.004 引用本文：屠凌岚,颜冬梅.WBSCR22 基因调控人恶性肿瘤细胞铁死亡的研究J.中国现代应用药学,
4、2023,40(2):172-178.Study on the Regulation of Ferroptosis in Cancer Cells by WBSCR22 Gene TU Linglan,YAN Dongmei*(School of Laboratory Medicine and Bioengineering,Hangzhou Medical College,Hangzhou 310013,China)ABSTRACT:OBJECTIVE To investigate whether WBSCR22 was involved in ferroptosis.METHODS The
5、siRNA targeting human WBSCR22 gene(siWBSCR22)was designed and synthesized,which was transient transfected to knockdown WBSCR22 mRNA.The level of WBSCR22 mRNA and protein were measured by RT-qPCR,Western blotting,respectively.The human colorectal cancer cell lines HCT116,RKO,lung cancer cell lines H4
6、60,and hepatoma cell line SMMC7721 were treated with the ferroptosis inducer Erastin,RSL3 alone or in combination with antioxidant NAC,necrosis inhibitor NSA,apoptosis inhibitor ZVAD-FMK,autophagy inhibitor 3-MA,and cell death rate was measured by CCK8.In addition,the cellular lipid peroxidation was
7、 measured by MDA assay and the cellular concentration of Fe2+was measured by Fe assay.RESULTS Transient transfection of siWBSCR22 significantly reduced the mRNA and protein levels of WBSCR22.WBSCR22 knockdown significantly promoted the ferroptosis induced by Erastin and RSL3 in HCT116,RKO,H460,and S
8、MMC7721 cells;the addition of NAC significantly reduced ferroptosis,while NSA,ZVAD-FMK,and 3-MA had no effect on ferroptosis.Erastin or RSL3 treatment significantly increased lipid peroxidation in cancer cells,which led to ferroptosis.However,Erastin or RSL3 did not alter the Fe2+concentration in ce
9、lls.CONCLUSION WBSCR22 gene regulates ferroptosis in cancer cells.KEYWORDS:WBSCR22;ferroptosis;cancer cell;lipid peroxidation;Fe2+基金项目：浙江省自然科学基金项目(LY12H31009)；浙江省医药卫生科技计划项目(2014KYA045，2021YK646)作者简介：屠凌岚，女，硕士，助理研究员 E-mail: *通信作者：颜冬梅，女，硕士，副研究员 E-mail: 铁死亡是 2012 年发现的一种铁依赖性非凋亡形式的细胞死亡方式，其特征是脂质过氧化物和活性氧(re
10、active oxygen species，ROS)过量积累，进而损害蛋白质、核酸和脂质等大分子物质，导致细胞损伤或死亡1-2。恶性肿瘤细胞内 ROS 水平通常较正常细胞高，因而与 ROS 有关的铁死亡对恶性肿瘤的影响引人关注。近年来，大量研究揭示铁死亡与人类恶性肿瘤(卵巢恶性肿瘤、头颈部癌、弥漫性大 B细胞淋巴瘤、肾癌、肝癌、横纹肌肉瘤等)关系密切，铁死亡在肿瘤细胞生长增殖过程中发挥重要的调控作用，为诱导肿瘤细胞死亡提供了新的研究方向3。小分子铁死亡诱导剂如 Erastin、柳氮磺吡啶、索拉非尼已用于治疗多种癌症，如肾癌、白血病、胰腺癌4-8。然而，肿瘤细胞可以通过上调抗氧化酶及分子表达而耐
11、受铁死亡。因此，揭示细胞铁死亡调控机制对于开发个性化抗肿瘤策略至关重要。中国现代应用药学 2023 年 1 月第 40 卷第 2 期 Chin J Mod Appl Pharm,2023 January,Vol.40 No.2 173 人 WBSCR22基因位于染色体第 7对的长臂近端(7q11.23)，其编码蛋白在多种恶性肿瘤细胞中高表达，参与肿瘤的发生、发展、增殖、侵袭、转移、化疗药物耐受及代谢异常9-13。研究发现，敲低 WBSCR22 显著提高人结直肠癌细胞对化疗药物奥沙利铂敏感性，奥沙利铂诱导肿瘤细胞产生 ROS 是其重要抗肿瘤机制之一，抗氧化剂 N-乙酰-L-半胱氨酸(N-acet
12、yl-L-cysteine，NAC)可降低奥沙利铂抗肿瘤作用14，而 ROS 过量积累亦是细胞铁死亡主要生化特征，推测WBSCR22基 因 可 能 参 与 调 控 细 胞 铁 死 亡，目 前 尚 无WBSCR22 基因调控细胞铁死亡及机制研究相关文献报道。因此本研究旨在初步探究 WBSCR22 是否参与调控肿瘤细胞铁死亡，为后续阐明机制奠定基础，为临床精准化、个体化肿瘤治疗提供新靶点和新策略。1 材料 1.1 细胞 人结直肠癌细胞系 RKO 及 HCT116、人肺癌细胞系 H460、人肝癌细胞系 SMMC7721 均购自中科院上海细胞库。1.2 药物与试剂 胎牛血清(货号：SH30021.01
13、)、DMEM 培养基(货号：SH30084.03)均购自美国 Hyclone 公司；超敏 ECL(货号：40203ES80)、CCK8(货号：36208ES60)均购自上海翌圣生物科技公司；胰蛋白酶(货号：C0201)、BCA 蛋白定量试剂盒(货号：P0010)、5蛋白上样缓冲液(货号：P0015)均购自上海碧云天生物技术有限公司；Trizol(货号：GT0240)、Lipofectamine RNAiMAX 转染试剂(货号：2278706)均购自美国 Invitrogen 公司；10RIPA细胞裂解液(美国 Millipore 公司，货号：20-188)；逆转录试剂盒（美国 Promega
14、公司，货号：L5540）；Syber Green I(美 国Roche公 司，货 号：04913914001)；铁死亡诱导剂 Erastin、RSL3(上海陶术生物科技公司，货号分别为 T1765，T3646)；DMSO、NAC、自 噬 抑 制 剂 3-甲 基 腺 嘌 呤(3-methyladenine，3-MA)、凋亡抑制剂 ZVAD-FMK、坏死抑制剂(necrosulfonamide，NSA)、三氯乙酸(trichhloroacetic acid，TCA)、硫代巴比土酸(thiobarbituric acid，TBA)(美国 Sigma 公司，货号分别为 D2650，A7250，M928
15、1，V116，480073，T0699，T5500)；Tris 粉剂、NaCl 粉剂、EDTA 粉剂、Triton X-100、异丙醇、无水乙醇(上海生物工程有限公司，货号分别为 A100193，A100241，A500895，A600198，A507048，A500737)；WBSCR22 一抗(美国 Gene Tex 公司，货号：GTX105840)；Actin 一抗、HRP-兔二抗(美国 CST公司，货号分别为 8457，7074)；siRNA(苏州泓迅生物科技公司，批号：201800283)；qPCR 扩增引物(上海生物工程有限公司，批号：SG2019033596)。1.3 仪器 31
16、11 型二氧化碳培养箱、Nanodrop2000 紫外分光光度计(美国 Thermo 公司)；SW-CJ-1FD 超净工作台(苏州净化设备有限公司)；9700 PCR 仪、7500 Fast 荧光定量 PCR 仪(美国 ABI 公司)；SpectraMax iD5 多功能酶标仪(美国 MD 公司)；BSA124S-CW 电子天平(北京赛多利斯电子有限公司)；HHS-11-1 型恒温水浴箱(上海博迅医疗设备厂)；MDF-U3386S 型超低温冰箱(日本 Sanyo 公司)；凝胶成像系统、Power PacTM Basic 电泳仪(美国 BIO-RAD 公司)；移液枪(德国 Eppendorf 公司)。2 方法 2.1 细胞培养 肿瘤细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM完全培养基中，置于 37、5%CO2饱和湿度的细胞培养箱中传代培养。23 d 换液 1 次，使用 0.25%含 EDTA 的胰蛋白酶常规消化传代。实验用细胞均处于对数生长期。2.2 siRNA 瞬时转染敲低目的基因 设计合成靶向目的基因双链 siRNA：靶向人WBSCR22 基因的 siRNA(siWBSCR22)，其序列为
