1、第 22 卷第 6 期2022 年12月泰州职业技术学院学报Journal of Taizhou Polytechnic CollegeVol.22 No.6Dec.2022作者简介：卢慧敏（1994-），女，江苏泰州人，检验技师.通信作者：钱静宇（1996-），女，江苏泰州人，检验技师.基金项目：江苏省“六大人才高峰”项目（WSW-264，项目主持人：韩高华）；泰州市“311工程”资助课题（RCPY201813，课题负责人：韩高华）；泰州市人民医院院内课题指令性项目（ZL202024，项目主持人：卢慧敏）.miR-181a通过调节Bcl-2逆转白血病细胞的耐药作用卢慧敏，韩高华，钱静宇（南京
2、医科大学附属泰州人民医院，江苏泰州225300）摘要：目的 研究微小RNA-181a（miR-181a）和B淋巴细胞瘤-2基因（Bcl-2）在急性粒细胞白血病（AML）老年患者临床标本、人早幼粒急性白血病细胞株（HL60）及人早幼粒急性白血病细胞耐阿霉素株（HL60/ADR）中的表达，并探讨白血病化疗耐药与miR-181a之间的关系。方法 收集2019年1月至2021年3月经泰州市人民医院血液内科确诊的22例AML初诊者、12例完全缓解者、11例复发者和10例正常者资料。利用脂质体2000（Lipofectamine2000）转染试剂以转染寡核苷酸探针，实时荧光定量PCR检测miR-181a和
3、Bcl-2的表达水平，Western Blot方法检测Bcl-2的蛋白表达水平，MTT方法检测HL60和HL60/ADR细胞的存活率。结果 与缓解者比较，AML初诊者和复发者样本中miR-181a表达显著下降，Bcl-2的表达显著升高，差异均有统计学意义（P0.05）；同样地，与HL60细胞比较，HL60/ADR细胞中miR-181a表达显著下降，Bcl-2的表达显著升高，差异均有统计学意义（P0.01）。结论 miR-181a可通过对Bcl-2表达的调节以参与白血病耐药的形成，miR-181a可能成为逆转白血病耐药的重要靶点。关键词：白血病；耐药性；微小RNA-181a；B淋巴细胞瘤-2基因
4、；HL60/ADR中图分类号：R733.7文献标志码：A文章编号：1671-0142（2022）06-0069-05白血病是一类高度异质性的血液系统恶性肿瘤，按分化程度可分为急性和慢性。急性粒细胞白血病（Acute myeloid leukemia,AML）是由转化的造血干细胞（Acute myeloid leukemia,HSC）通过获得性遗传异常（包括染色体重排和多基因突变）而产生的克隆性扩增及造血分化受损导致的。因其恶化快速，若没有进行适当的治疗可能在短时间内致命。获得性突变增强HSC的自我更新和增殖，其中正常的分化机制受损，最终导致异常未成熟白血病原始细胞的克隆扩增，使得这些原始细胞在
5、骨髓中积累，逐渐取代正常的造血组织，干扰正常血细胞的产生，导致造血功能受损和骨髓衰竭，出现血细胞减少的现象1。AML常在老年人中高发。据报道，AML 的发病率为每 100，000 人 35 例，中位诊断年龄约为 68 岁。虽然AML在男性中的发病率略高于女性（比例为53），但在种族和民族上相似。目前，只有大约35%40%的小于60岁的患者和5%15%的大于 60 岁的患者可治愈该疾病。10%40%的患者在强化诱导治疗后仍未达到CR，并被认为患有原发性难治性疾病。尽管部分患者能够达到CR，超过50%的患者随后疾病复发。对于复发的患者，其中只有一小部分患者能成功获得第二次CR。此外，鉴于并存疾病和
6、缺乏合适的供体，这些患者通常不适合进行异体造血干细胞移植（alloHSCT）治疗。因此，这为复发性和难治性AML的治疗留下了巨大的临床需求2。miR-181a是研究较多的一种与造血调控相关的 MicroRNA（miRNA），与 B 细胞分化相关。miR-181a与多种肿瘤细胞如胶质瘤、胰腺癌等增泰州职业技术学院学报第6 期殖侵袭相关3,4。近年，miR-181a与白血病的关系也广受关注，Li等5研究发现miR-181a可促进柔红霉素耐药的K562/A02细胞凋亡。miR-181a与白血病细胞耐药之间的关系及其分子机制，目前鲜有报道，本研究从临床标本出发，通过进一步分析HL60及其阿霉素耐药株H
7、L60/ADR细胞中miR-181a和Bcl-2的表达差异，探讨miR-181a与白血病细胞耐药的关系。1材料与方法1.1研究对象选取2019年1月至2021年3月经泰州市人民医院血液内科确诊的AML患者45例，其中初诊 22 例，完全缓解者 12 例，复发 11 例。男性25例，女性20例；年龄6380岁，中位年龄67.45岁。正常对照10例，其中男性5例，女性5例；年龄5278岁，中位年龄64.57岁。1.2骨髓标本有核细胞分离取EDTA-K2抗凝的骨髓标本1.5ml加入红细胞裂解液58ml，充分混匀，放置约 10min，直至红细胞完全破坏。1500r/min离心5min，丢弃上清，滴加约
8、10ml生理盐水重悬，1500r/min离心5min，共洗涤 3次。弃上清后加入1ml Trizol液，再转移到EP管里，保存于-80冰箱以备用。1.3寡核酸探针所有寡核酸探针均购自广州锐博生物有限公司，miR-181a模拟物序列是5-AACAUUCAACGCUGUCGGUGAGU-3；miR-181a抑制物序列是5-UCACCGACAGCGUUGAAUGUUUU-3；对照序列是UUCUCCGAACGUGUCACGUTT。1.4细胞培养与转染HL60及HL60/ADR细胞购于中国科学院上海细胞库，均用含10胎牛血清（Gibco，USA）的RPMI1640培养基（Gibco，USA），并将细胞培
9、养于 37、5CO2培养箱。加入1.0mg/L 阿霉素（深圳市思美泉生物科技有限公司）以维持HL60/ADR细胞株的耐药性，停药2周后进行后续实验。HL60及HL60/ADR 细胞培养于六孔板中，当细胞融合度达到8090%时细胞转染。细胞转染过程均按脂质体 2000（Invitrogen,USA）试剂说明书进行实验。脂质体2000的终浓度为1g/mL，寡核苷酸及质粒的转染终浓度分别为200 nmol/L及1g/mL。将寡核苷酸及质粒与脂质体2000置于无血清RPMI 1640培养基中混匀，用于后续细胞转染实验，48h后收集细胞以进行细胞生物学实验。1.5MTT法检测细胞存活率以48孔板上每孔4
10、104个细胞的密度接种于细胞板内，细胞在培养箱中培养过夜后转染寡核酸探针。细胞转染24h后，将配好的不同浓度的阿霉素加入细胞中，最后置于培养箱中培养。处理48h后，向每孔中加入25 l配好的 MTT溶液，再置于培养箱中培养。4h后将48孔板中的培养液倒掉，每孔加入300 lDMSO溶解蓝色结晶，然后将48孔板放入酶标仪中37孵育10 min，在570 nm下测定每孔的吸光度。1.6实时荧光定量PCR检测miR-181a和BCL-2的表达利用 Trizol（Invitrogen,USA）提取骨髓有核细胞、HL60细胞或HL60/ADR细胞的总RNA。采 用 TaqMan MicroRNA Rev
11、erse Transcription Kit（Life Technologies,USA）将总RNA逆转录成特定microRNA的cDNA：miR-181a和内参U6的特异性逆转录引物分别为：5-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTAT-TCGCACTGGATACGACACTCAC-3；5-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGA-GGTATTCGCACTGGATACGACACGATT-3。使用 TaqManMicroRNA Assay Kit（Applied Biosystems,USA）检测miR-181a的表达水平。其中miR-181a和U6定量PCR上游引物分别为
12、：5-GAACATTCAACGCTGTCG-3；5-CCTGCGCAAGG ATGAC-3。下游引物均为 5-GTGCAGGGTCCGAGGT-3。采用 ReverTra Ace qPCR RT Kit（TOYOBO,Japan）将总 RNA 逆转录成 cDNA，并使用 SYBR GreenRealtime PCR Master Mix（TOYOBO,Japan）检测Bcl-2 的 mRNA 水平。其中 Bcl-2 定量引物序列为 5-ATGGCGCACGCTGGGAGAACAGGGT-3（上游引物）和 5-ACAGCCAGGAGAAATCAAACAGAGGC-3（下游引物）。使用-Actin
13、作为内参，其序列为5-CAGAGCCTCGCCTTTGCC-3（上游引物）和5-GTCGCCCACATAGGAATC-3（下游引物）。PCR扩增程序如下：94变性5 min,随后 94作用30 s，60作用30 s，72作用40 s，共进行40个循环。1.7Western Blot实验将HL60或HL60/ADR细胞置于RIPA裂解液中（50 mM TrisHCl,pH 7.4;1%NP-40;150 mM NaCl;1 mM EDTA；1 mMphenylmethylsulfonyl fluoride）。使用10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-Polyacrylamidegelelec
14、troph-oresis,SDS-PAGE）将蛋白进行分离，再转移到PVDF膜（Millipore,USA）上。将PVDF膜置于5%脱脂奶粉里封闭 2h 后，将其置于 4用 Bcl-270第 6 期卢慧敏，韩高华，钱静宇：miR-181a通过调节Bcl-2逆转白血病细胞的耐药作用（Abcam,UK）或-actin抗体（Santa Cruz Biotechnology,Canada）孵育过夜，抗体使用稀释度均为11000。第二天将辣根过氧化物酶标记的二抗滴加于PVDF膜上，在室温中孵育1小时。ECL显色后曝光。1.8统计学方法采用Graphpad Prism 5软件进行分析，应用配对 T 检验进
15、行统计学分析，以 P0.05）。而与缓解者的样本比较，初诊者和复发者样本中miR-181a表达量均下降，Bcl-2的表达量均升高，差异均有统计学意义（P0.05）。这一结果说明miR-181a低表达以及Bcl-2的高表达可能与临床复发相关。图1miR-181a和Bcl-2在临床样品中的表达水平2.2HL60 及 HL60/ADR 细 胞 中 miR-181a 和Bcl-2的表达水平实时荧光定量PCR分别检测HL60 和 HL60/ADR 细胞中 miR-181a 和 Bcl-2 的mRNA表达水平变化。结果如图2所示，与HL60细胞比较，HL60/ADR细胞中miR-181a的mRNA表达水平
16、明显降低，差异有统计学意义（P0.01）；而 HL60/ADR细胞中Bcl-2的表达水平明显升高，差异有统计学意义（P0.01）。WesternBlot 检测结果如图 3 所示，与 HL60 细胞比较，HL60/ADR细胞中Bcl-2的蛋白表达水平明显升高，差异有统计学意义（P0.01），表明miR-181a低表达及Bcl-2的高表达与细胞耐药紧密相关。2.3miR-181a能逆转白血病细胞的耐药性将miR-181a 模拟物转染入 HL60/ADR 细胞中。24h之后，将配好不同浓度的阿霉素（0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4mg/ml）加入细胞中。刺激48h，通过 MTT 法检测处理后细胞的存活率，并计算细胞的半数抑制浓度 IC50。结果如图4A所示，未转染的HL60/ADR细胞IC50值为4.67 mg/ml。与转染对照寡核苷酸探针的 HL60/ADR 细胞比较，转染miR-181a模拟物的细胞的存活率显著降低，差异有统计学意义（P0.01）。转染对照探针的细胞IC50为3.69 mg/ml，而转染miR-181a模拟物的细胞IC50为1.44 mg/ml，说明细胞对药
