1、包载替莫唑胺和索拉非尼 PLGA 纳米粒的制备及评价成倩1，王振杰2，牟青春2，周迩2，张羽飞1(1桂林医学院，广西壮族自治区桂林541002;2高州市人民医院，广东茂名525099)摘要:目的制备替莫唑胺和索拉非尼 PLGA 纳米粒，并对其粒径、形貌、稳定性及体外释放进行考察，探讨其是否可用于抗脑胶质瘤的体内体外研究。方法纳米沉淀法制备替莫唑胺索拉和索拉非尼 PLGA 纳米粒，测定粒径、电位、形貌、包封率和载药量以及稳定性。结果所得纳米粒的平均粒径为(10671021)nm、多分散系数为(024005)，电位(2730120)mV，纳米粒呈规则的球状均匀分布，大小均一，表面光滑;PLGA 纳
2、米粒中替莫唑胺的包封率及载药量分别为(7589312)%、(361078)%;索拉非尼的包封率及载药率分别为(4861120)%、(150098)%。结论采用纳米沉淀法制备的 PLGA 纳米粒，呈球形形貌、粒径分布均匀、有良好的稳定性，可用于抗脑胶质瘤的体内体外研究。关键词:替莫唑胺;索拉非尼;PLGA;纳米粒;胶质瘤中图分类号:944文献标识码:A文章编号:10017550(2023)01010604基金项目:广东省茂名市科技专项计划项目(2020KJZX007);广东省医学科研基金项目(B2021398)作者简介:成倩(1997)，女，硕士研究生，研究方向:纳米药物与肿瘤。通讯作者:张羽飞
3、，副教授，研究方向:糖尿病及其并发症机制研究。Development and characterization of temozolomide and sorafenibloaded PLGA nanoparticlesCHENGQian et al(Guilin Medical College，Guilin 541002，China)Abstract:ObjectiveTo prepare polylactic acidglycolic acid(PLGA)nanoparticles loaded with temozolomide combined withsorafenib，and to
4、 investigate their particle size，morphology，stability and in vitro release，and to explore whether they can be used for invitro and in vivo studies of antigliomaMethodsTemozolomide and sorafenibPLGA nanoparticles were prepared by nano precipitati-on methodWe characterized the pharmaceutical and biolo
5、gical properties of the nanoparticles，including particle size，potential，morphol-ogy，encapsulation rate，drug loading and stability were determinedesultsThe average size of the nanoparticles was(10671021)nm，the polymer dispersity index was(014005)，and the Zeta potential was(2730120)mVThe nanoparticles
6、 showed regularspherical uniform distribution，uniform size and smooth surfaceThe encapsulation rate and drug loading of temozolomide in PLGA nano-particles were(7589312)%and(361078)%，respectivelyThe encapsulation rate and drug loading rate of sorafenib were(48.61120)%and(150098)%，respectivelyConclus
7、ionThe PLGA nanoparticles prepared by nanoprecipitation method，shows spherical shape and uniform size distribution and good stability with high drug loading and entrapment efficiencies，which can beused for in vitro and in vivo antiglioma researchKey words:temozolomide;sorafenib;PLGA;nanoparticles;gl
8、ioma脑胶质瘤，是一种常见的发生于中枢神经系统的原发性肿瘤，多发于成人，具有“三高”(恶性程度高、发病率高、致残率高)的特点1。目前治疗的方式主要以手术为主，放疗、化疗以及基因治疗等，但预后不良，且由于血脑屏障的存在，使得大多数药物难以透过血脑屏障，成为胶质瘤预后差的亟待解决的问题23。替莫唑胺是治疗胶质瘤的一线药物，可穿过血脑屏障，具有良好的治疗效果，但其耐药性不可忽视4。索拉非尼是一种多靶点抗肿瘤药物，在合用其他抗肿瘤药物的晚期癌症治疗中，体现出良好的安全性以及抗肿瘤活性5。纳米载药系统具有更多的优势(提高生物利用度，药物稳定性，特异性)，在药物递送方面发挥重要作用67。聚乳酸(PLA)
9、羧基乙酸(PGA)共聚物 Poly(lacticcoglycolic acid)，PLGA是一种具有良好可降解性与生物相容性的一种高分子聚合物，包载药物可延长药物的作用时间89。本研究拟以高分子聚合物材料 PLGA 为载体，将替莫唑胺和索拉菲尼包载在PLGA 纳米粒中，实现两种药物的共同递送，以共同发挥抗胶质瘤作用。1材料11仪器集热式恒温磁力搅拌器(上海勒顿实业有限公司);纳米粒度及电位分析仪(英国 Malvern6012023 年 02 月牡丹江医学院学报Feb.2023第 44 卷第 1 期JournalofMuDanJiangMedicalUniversityVol.44No.1202
10、3DOI:10.13799/ki.mdjyxyxb.2023.01.005公司);透射电子显微镜;电子分析天平(赛多利斯科学仪器有限公司);CO2培养箱(美国 Thermo For-ma 公司);高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)。12试药替莫唑胺、索拉非尼、四氢呋喃均购于上海麦克林生化科技股份有限公司，聚乳酸羟基乙酸共聚物(PLGA5KmPEG2K 50/50)购于西安齐岳生物科技有限公司，其他试剂均为市售分析纯。2方法21纳米粒的制备采用纳米沉淀法制备荷载替莫唑胺和索拉非尼的 PLGA 纳米粒(TSPLGA)。精密称量 PLGA 10 mg、替莫唑胺 05 mg、索拉非尼03 mg，溶于 4
11、00 L 四氢呋喃中，形成有机相，在 37水浴快速搅拌条件下，将上述四氢呋喃溶液缓慢滴加至 1 mL 去离子水中，搅拌 1 h 挥干有机溶剂，即得 TSNP 纳米溶液，但有部分药物分散于纳米溶液中，将制得的纳米粒通过 022 m 的微孔滤膜，滤液备用。22纳米粒的粒径、电位的测定取上述制得的纳米粒溶液 1 mL 于测量杯中，采用粒度分析仪测定TSPLGA 的粒径、多分散系数(Polydispersity Index，PDI)以及 Zeta 电位，每个样品进行三次测量，计算平均值。23纳米粒的形貌考察取 10 mL TSPLGA，滴加于铜网上沉淀 1 min，滤纸吸去浮液，醋酸双氧铀 10L 滴
12、加于铜网上沉淀 1 min，滤纸吸去浮液，室温下自然挥发溶液后，80120 kv 进行电镜检测成像。24方法学的研究和纳米粒的含量测定利用高效液相色谱法(High performance liquid chromatogra-phy，HPLC)测定 TSPLGA 的包封率(Encapsulationefficiency，EE)和载药率(Drug loading，DL)。色谱条件:色谱柱 C18 柱(200 mm46 mm，5 m)，流动相为乙腈水(体积比 80 20)，波长检测 280 nm(运行时间均为 010min)，流速为 1 mL/min，柱温30，进样量 20 L。线性范围:分别精密
13、称取替莫唑胺 5 mg 和索拉非尼标准品 5 mg，分别置于 5 mL 容量瓶中，加甲醇完全溶解后并稀释至刻度线，分别配置成 1 mg/mL替莫唑胺甲醇溶液和 1 mg/mL 索拉非尼甲醇溶液。稀释成不同浓度，按照上述色谱条件进样，记录峰面积，进行线性回归，绘制标准曲线。方法学研究:对精密度和加样回收率考察，参照中国药典 2020 年第四部 9101 药品质量标准分析方法验证指导原则进行10。分别精密吸取同一对照品溶液，按以上进样条件分别连续进样 6 次，进样量 20 L，进行精密度考察。取已知含量的纳米溶液，取样 6 次，每份 1 mL，并加入 0025 mg/mL 的替莫唑胺对照品溶液 1
14、 mL 和甲醇 1 mL，超声并过0.22 m 滤膜，按照以上色谱条件测定。索拉非尼对照品溶液浓度设为 01 mg/mL，其他操作均与替莫唑胺相同。TSPLGA 包封率和载药率的测定:TPPLGA采用最佳工艺制备，通过 HPLC 法检测所制备纳米粒的包封率和载药率。使用甲醇对共载纳米粒进行破乳，精密吸取 100 L 的纳米粒加 900 L 甲醇溶解纳米粒超声破膜，022 m 水系滤膜滤过，取滤液进样测定替莫唑胺和索拉非尼的峰面积，并通过标准曲线计算得到包封率和载药率，每个样品进样三次测量，计算平均值。EE=(包裹的药物质量/最初加入的药物质量)100%DL=(包裹的药物质量/最初加入的药物质量
15、+PLGA 的质量)100%25纳米粒的稳定性考察将上述操作制备的 TSPLGA 纳米溶液放在 4 冰箱避光保存，分别于第 1、3、5、7、14、21 天测定其粒径及 PDI，判断其稳定性。26纳米粒的体外释放考察采用透析扩散法考察 TSPLGA 和替莫唑胺/索拉非尼的四氢呋喃溶液在 pH=74 PBS 中的体外释药行为。精密吸取 2mL 的 TSPLGA 装入透析袋(截留分子量 3500)，排除气泡，用夹子夹紧透析袋的两侧，用橡皮筋固定并将透析袋完全浸没于 20 mL pH=74 PBS 中。透析袋置于 100 rpm/min，37 的摇床上震荡，在不同时间点取1 mL 的释放介质并补充等量
16、的新鲜介质，通过紫外分光光度法测定不同时间点的药物浓度，计算累计释放率，绘制体外释放曲线。3结果31纳米粒的粒径和电位通过纳米沉淀法制备TSPLGA，其粒径及 Zata 电位如图 1 所示，A 图表图 1TSPLGA 的粒径及 Zeta 电位图注:A:TSPLGA 的粒径图;B:TSNP 的 Zeta 电位图7012023 年 02 月牡丹江医学院学报Feb.2023第 44 卷第 1 期JournalofMuDanJiangMedicalUniversityVol.44No.12023示纳米粒的平均粒径为(10671021)nm，B 图多分散系数为(02430053)，电位为(273120)mV。32纳米粒的形貌观察用透射电镜观察纳米粒，可看出纳米粒呈规则的球体均匀分布，大小均一，表面光滑，无聚集，也无晶体析出，见图 2。图 2TSPLGA 的透射电镜图33纳米粒的包封率及载药量的测定采用 HPLC法测定 TSPLGA 中替莫唑胺和索拉非尼含量。在相同的色谱条件下，替莫唑胺的出峰时间在 21min，索拉非尼的出峰时间在 38 min，两药物出峰时间无重叠，见图 3。替莫唑胺在 110
