1、第一作者简介:李湘杰,硕士,研究方向:炎症性肠病的诊断和治疗。E-mail:lxjyolo 通讯作者:沈磊,博士,教授,主任医师,博士生导师,研究方向:消化内镜的诊断 和 治 疗,炎 症 性 肠 病 的 诊 断 和 治 疗。E-mail:szggyx2017 doi:10.3969/j.issn.1006-5709.2023.01.008VX-680 对小鼠实验性结肠炎 NF-B 通路的调节作用李湘杰,严博,周林香,乔雨晴,沈磊武汉大学人民医院消化内科 消化系统疾病湖北省重点实验室,湖北 武汉 430060【摘要】目的探究极光激酶 A(Aurora-A)抑制剂(VX-680)对小鼠实验性结肠炎
2、的作用以及对 NF-B 通路的调节作用。方法选择 18 只体质量相近的 C57BL/6 小鼠,随机分为 3 组,每组各 6 只:对照组(正常饮水+10%DMSO 溶剂腹腔注射 7 d)、DSS 模型组(3%DSS 饮水造模+10%DMSO 溶剂腹腔注射 7 d)、治疗组3%DSS 饮水造模+VX-680(40 mg/kg)腹腔注射 7 d。记录小鼠肠炎疾病活动指数(disease activity index,DAI)和结肠组织病理评分,ELISA 检测小鼠结肠组织炎性因子 IL-1、IL-6、IL-10、TNF-、IFN-的变化,qRT-PCR 检测 Mucin-1、Mucin-2、NF-B
3、 p65 的 mRNA 表达,检测 Aurora-A 和 NF-B 通路中 NF-B p65、IRF-5 的蛋白表达。结果与对照组相比,DSS 模型组 DAI 评分和组织病理学评分更高(P0.01),促炎因子 IL-1、IL-6、TNF-、IFN-的表达上升(P0.01),Mucin-1、Mucin-2 的 mRNA 水平下降(P0.01),NF-B p65、IRF-5 的表达水平上升(P0.01);治疗组对上述改变有缓解作用(P0.01)。结论VX-680 可通过 NF-B 通路抑制肠道炎症,保护肠道黏膜。【关键词】VX-680;结肠炎;NF-B 通路;IRF-5中图分类号:R574.62文
4、献标识码:A文章编号:1006-5709(2023)01-0036-05收稿日期:2022-01-12Effects of VX-680 on the regulation of NF-B pathway in experimental colitis in miceLI Xiangjie,YAN Bo,ZHOU Linxiang,QIAO Yuqing,SHEN LeiDepartment of Gastroenterology,Renmin Hospital of Wuhan University,Hubei Key Laboratory of Digestive System Disea
5、se,Wuhan 430060,China【Abstract】ObjectiveTo investigate the effect of Aurora-A inhibitor(VX-680)on experimental colitis in mice and the regulation of NF-B pathway.MethodsEighteen C57BL/6 mice of similar body weight were selected and randomly divided into three groups of six mice each:control group(no
6、rmal drinking water+10%DMSO solvent intraperitoneally for 7 days),DSS model group(3%DSS drinking water modeling+10%DMSO solvent intraperitoneally for 7 days),and treatment group 3%DSS drinking water modeling+VX-680(40 mg/kg)intraperitoneally for 7 days.The disease ac-tivity index(DAI)and colon histo
7、pathology score of mice with enteritis were recorded,and the changes of inflammatory factors IL-1,IL-6,IL-10,TNF-and IFN-in mice colon tissue were detected by ELISA.mRNA expression of Mucin-1,Mucin-2 and NF-B p65 was detected by qRT-PCR,Aurora-A and NF-B p65,IRF-5 protein expression in NF-B pathway
8、was detected.ResultsCompared with the control group,the DSS model group had higher DAI score and histopathology score(P0.01),and the expression of pro-inflammatory factors IL-1,IL-6,TNF-,and IFN-was increased(P0.01),Mucin-1 and Mucin-2 mRNA levels were decreased(P0.01),and expression level of NF-B p
9、65 and IRF-5 was increased(P0.01);the treatment group had a mitigating effect on the above changes(P15%腹泻肉眼血便1.3.2组织病理学评分:先将结肠组织用酒精和二甲苯处理后用石蜡包埋。将蜡块切片为 5 mm 薄片,加热后放置于载玻片上。用二甲苯和酒精处理组织玻片后,分别用苏木精和伊红染料染色,并洗去多余染料。封片后用电镜观察结肠组织病理学改变。根据组织学评分标准9,通过 HE 染色切片对结肠黏膜形态和炎症细胞浸润进行评分(见表 2)。表 2组织病理学评分Tab 2Histopathology
10、 scores评分炎细胞浸润组织缺损组织破坏范围腺体黏膜破坏0 分无无无无1 分固有层浸润黏膜糜烂25%1/32 分黏膜下层浸润黏膜溃疡50%2/33 分固有肌层浸润广泛损伤75%仅上皮完好4 分-75%全部丢失1.3.3细胞因子浓度的测定:将冻存的结肠组织经过PBS(0.01 mol/L,pH=7.4)冲洗、1 9 重量体积比的PBS 冰浴研磨,离心机 3 000 r/min 离心 10 min 后取上清液检测。在 ELISA 试剂盒中设孔加样后 37 孵育90 min,弃液后加入生物素化抗体工作液 37 温育1 h,弃液洗板 3 次,加入酶结合物工作液后 37 温育30 min,弃液洗板
11、5 次,加显色剂(TMB)后 37 避光孵育 30 min,加终止液后用酶标仪测量各孔的 OD 值。将结肠组织在 pH=7.4 的磷酸盐缓冲液中匀浆,在4 和 3 000 r/min 下离心 15 min,收集上清液以测定细胞因子浓度。细胞因子包括 TNF-、IFN-、IL-1、IL-6、IL-10。1.3.4qRT-PCR 分析:在结肠组织中加入 Trizol 试剂,研磨后裂解。裂解后加入 200 l 氯仿充分混合后静置 5 min,后 12 000 r/min 离心 15 min。取上层水相加入等体积异丙醇静置后再次离心处理。弃上清液加入 75%乙醇后离心处理并重复一次该过程。弃上清液后将
12、干燥 RNA 沉淀 10 min,溶于 20 l DEPC 水中,用微量分光光度计测定 OD260、OD280以及 OD260/OD280值,计算 RNA 的纯度和浓度。用逆转录反应体系逆转录成 cDNA,将 cDNA 稀释5 倍后,用 qRT-PCR 反应体系和反应程序进行 qRT-PCR 检测。以-actin 作为内参。引物如表 3 所示。表 3引物序列Tab 3Primer sequence引物引物序列(5-3)扩增长度/bp-actin上游:CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC240下游:TAAAGACCTCTATGCCAACACAGTMucin-1上游:ACAGTTCAC
13、CCCAGTTGTCT197下游:GCCTGACCTGAACTTGATGCMucin-2上游:CCCACACTTTGTCACCTTCG239下游:TGTTCACCTGTACCTCCACCNF-B p65 上游:GCCAAAGAAGGACACGAC261下游:ATCACCCTCCAGAAGCAG73胃肠病学和肝病学杂志2023 年 1 月第 32 卷第 1 期Chin J Gastroenterol Hepatol,Jan 2023,Vol.32,No.11.3.5Western blotting 分析:Western blotting 检测小鼠结肠组织中 Aurora-A、NF-B p65 和
14、 IRF-5 的蛋白表达变化。结肠 组织中添 加含 2 l PMSF、2 l 磷酸酶抑制 剂 的 裂 解 液、钢 珠 后 研 磨 裂 解 离 心(4 ,12 000 r/min,20 min),提取组织总蛋白,测定蛋白浓度。将提取的蛋白与 5蛋白上样缓冲液(体积比按照4 1 混合)在水浴中煮沸 10 min。将制备好的蛋白样品进行电泳及电转后,将印有蛋白的 PVDF 膜用封闭液在室温下摇床封闭 2 h。封闭后置于一抗孵育液中,4 孵育过夜。一抗孵育后的 PVDF 膜用 TBST 充分洗涤后,置于 HRP 标记二抗(1 50 000)中孵育 2 h。二抗孵育后用 TBST 充分洗涤,滴加 ECL
15、 试剂显影后扫描胶片,用 IPP 分析胶片灰度值。1.4统计学分析采用 SPSS 26.0 软件进行统计分析,使用 GraphPad Prism 8 软件绘制统计图。均数比较采用单因素方差分析。P0.05 为差异有统计学意义。2结果2.1DAI 评分和结肠大体观变化在实验过程中,所有小鼠均未死亡。对照组小鼠无结肠炎表现,DSS模型组和治疗组的小鼠均有体质量下降、血便症状。DSS 模型组的 DAI 评分高于对照组(P0.01),治疗组DAI 评分比 DSS 模型组低(P0.01)。对照组小鼠的结肠表现正常,但 DSS 模型组和治疗组小鼠结肠长度均缩短,并伴有充血水肿现象,但治疗组小鼠结肠缩短及充
16、血水肿的程度明显轻于 DSS 模型组(见图 12)。注:A:体质量变化;B:结肠长度;C:DAI 评分。与 DSS 模型组相比,P0.01。图 1体质量变化、结肠长度和 DAI 评分Fig 1Weight change,colon length and DAI scores注:A:对照组;B:DSS 模型组;C:治疗组。图 2结肠大体观Fig 2Gross view of the colon2.2组织病理学评分对照组小鼠组织未见异常结构,DSS 模型组和治疗组均有结构异常,如黏膜溃烂、腺体破坏或炎症细胞浸润。治疗组小鼠的组织炎症情况有所改善。通过组织病理学评分分析,DSS 模型组的结肠组织病理学评分显著升高(P0.01),治疗组组织病理学评分明显降低(P0.01)(见图 3)。2.3炎性因子表达与对照组相比,DSS 模型组小鼠促炎症细胞因子 TNF-、IFN-、IL-1 和 IL-6 的表达明显升高(P0.01)。治疗组小鼠促炎症细胞因子的表达被显著抑制,而抗炎细胞因子 IL-10 表达高于 DSS模型组(P0.01)。因此,DSS 模型组炎症反应显著,而治疗组的小鼠炎症情况得到缓解(
