1、药品无菌检查及相关知识药品无菌检查及相关知识 吉林省药品检验所微生物室 主要内容主要内容 1、药品无菌检查法基础药品无菌检查法基础 2、2015年版药典无菌检查法的变动年版药典无菌检查法的变动 3、洁净实验室微生物的监测和控制、洁净实验室微生物的监测和控制 4、菌种的管理、菌种的管理 5、二级生物安全实验室、二级生物安全实验室 药品无菌检查法药品无菌检查法 定义及特点定义及特点 培养基、冲洗液培养基、冲洗液 方法学验证方法学验证 供试品的无菌检查供试品的无菌检查 无菌检查的要点无菌检查的要点 药品药品无菌检查法无菌检查法 无菌检查法系用于检查药典要求无菌的药品、生物制品、医疗器具、原料、辅料、
2、及其他品种是否无菌的一种方法。若供试品符合无菌检查法的规定,仅表明了供试品在该检验条件下该检验条件下未发现微生物污染。也并不表示所有的产品都是无菌的。反之，当供试品中检出微生物污染，则可以认为批产品的微生物污染风险相当高。药品无菌检查法药品无菌检查法 无菌制剂比非无菌制剂存在更高的风险 一系列的药品不良事件 2006年的“欣弗事件”-安徽华源生产的“克林霉素磷酸酯葡萄糖注射液”引起了11人死亡，93人感染，企业倒闭，总经理自杀。未按批准的工艺参数灭菌，降低灭菌温度、缩短灭菌时间，增加灭菌柜装载量，影响了灭菌效果，经中检所检验，发现无菌不合格。2012年10月，美国新英格兰合成制药中心生产的注射
3、用类固醇霉菌污染，造成数百人感染真菌脑炎，至年底统计死亡39人。这些事故促使无菌制剂GMP监管的进步，同时也对无菌检验提出更高更严的要求。药品无菌检查法药品无菌检查法 特点特点 无菌检验结论为一次性一次性，药典规定为不得复试，为什么不得复试，菌落的分布具有不均匀性，检验过程是破坏性的，不具有重复性。-对操作过程的要求非常高。过程的控制-1、环境控制；2、操作影响，人员、物流是否引入外源性污染？无菌性检查无菌性检查 灵敏度检查灵敏度检查 SOP操作操作 有效的结果有效的结果 有效的方法有效的方法 环境保证环境保证 培养基保证培养基保证 方法学验证方法学验证 过程控制过程控制 结果判断结果判断 可
4、靠的结论可靠的结论 药品无菌检查法药品无菌检查法 培养基培养基 配制后采用验证合格验证合格的灭菌程序灭菌。什么是验证合格的？保存条件：2-25、避光，非密闭容器在3周内使用，密闭容器一般在1年内使用。流乙醇酸盐流体：供试品接种前，培养基氧化层不超过深度的1/5，否则100水浴加热至粉红色消失（不超过20分钟），只能加热一次，培养结束后氧化层不超过1/2 药品无菌检查法药品无菌检查法 药品无菌检查法药品无菌检查法 培养基适用性检查培养基适用性检查 无菌性无菌性每批次培养基取不少于5瓶（支），培养14天，应无菌生长。灵敏度灵敏度 6种菌（100cfu）金、铜绿、生孢-流乙醇酸盐流体 7支，12ml
5、/支，每种菌接种2支，阴性一支，枯草、白念、黑曲-胰酪大豆胨液体 7支，每种菌接种2支，9ml/支，一支阴性 流乙醇酸盐流体培养3天，胰酪大豆胨液体 5天，空白对照管应无菌生长，若加菌的培养基管均生长良好，判断该培养基的灵敏度符合规定 药品无菌检查法药品无菌检查法 冲洗液冲洗液 0.1%蛋白胨水溶液 pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液 可选用其他经验证过的适宜的溶液 药品无菌检查法药品无菌检查法 方法适用性试验方法适用性试验 证明所采用的方法适合于该产品的无菌检查。若检验程序或产品发生变化可能影响检验结果时，应重新进行方法适用性试验。菌种：菌种：金葡、大肠、枯草、生孢、白念、黑曲 方法：方法：1、
6、薄膜过滤 2、直接接种 药品无菌检查法药品无菌检查法 薄膜过滤法薄膜过滤法 试验组：试验组：取每种培养基规定接种的供试品总量按薄膜过滤法过滤，冲洗，在最后一次冲洗液中加入小于100cfu的试验菌，过滤。将培养基加至滤筒内。对照组：对照组：另取一装有同体积培养基的容器，加入等量试验菌，培养时间不得超过5天。药品无菌检查法药品无菌检查法 直接接种法直接接种法 取流乙醇酸盐流体培养基（不少于15ml）6管，分别加入金葡、大肠、生孢各2管，其中一管接入供试品，另一管作为对照，TSB（不少于10ml）6管，分别加入枯草、白念、黑曲各2管，其中一管加入供试品，另一管作为对照，培养时间不得超过5天。结果判断
7、：结果判断：与对照管比较，试验组的试验菌生长良好，则说明供试品的该检验量在该检验条件下无抑菌作用或抑菌作用可以忽略不计；如含供试品的任一容器中的试验菌生长微弱、缓慢或不生长-供试品的该检验量在该检验条件下有抑菌作用-增加冲洗量、培养基用量、中和剂或灭活剂、更换滤膜品种，重新进行方法适用性试验。药品无菌检查法药品无菌检查法 供试品的无菌检查供试品的无菌检查 检验数量：一次试验所用供试品最小包装容器的数量 出厂产品按表1，上市产品监督检验按表2 最少检验数量不包括阳性对照用的。检验量：按表3，采用薄膜过滤法时，只要供试品特性允 许，应将所有容器内的全部内容物过滤。药品无菌检查法药品无菌检查法 1、
8、薄膜过滤法、薄膜过滤法 封闭式薄膜过滤器 只要供试品性状允许，应采用薄膜过滤 抗生素样品选用低吸附的滤膜 水溶性供试品过滤前先将少量冲洗液过滤以润湿滤膜 油类供试品的滤膜和滤器在使用前应充分干燥 冲洗量一次一般为100ml，总冲洗量不得超过1000ml，以免膜上的微生物受损。总冲洗量特别大时应尽量减小流速。药品无菌检查法药品无菌检查法 水溶性的液体水溶性的液体-直接过滤或混合至含不少于100ml适宜稀释液的无菌容器中，混匀，立即过滤，如供试品有抑菌作用，须冲洗一般不少于三次。水溶性的固体水溶性的固体-溶取规定量，加适宜的稀释液溶解或按标签复溶。非水溶性供试品非水溶性供试品-直接过滤，或乳化后（
9、加吐温80等）立即过滤，用含0.1-1%吐温80的冲洗液冲洗，培养基中可加入吐温80 可溶于十四烷酸异丙酯的膏剂和黏性油性供试品可溶于十四烷酸异丙酯的膏剂和黏性油性供试品-溶解于适量无菌十四烷酸异丙酯中，过滤，加热仍然没法过滤的，萃取，静置，取水层过滤 无菌气雾剂无菌气雾剂-在-20冷冻1小时，取出在容器上钻一小孔释放抛射剂后再无菌开启容器，转移至无菌容器中。装有药物的注射器供试品装有药物的注射器供试品注意应采用适宜的方法进行包装中所配带的无菌针头的无菌检查 带有导管的医疗器具（输血、输液袋等）带有导管的医疗器具（输血、输液袋等）-每个最小包装用50-100ml冲洗液分别冲洗内壁，过滤冲洗液。
10、同时注意应采用直接接种法对配带的无菌针头做无菌检查 药品无菌检查法药品无菌检查法 2、直接接种法、直接接种法 培养基的用量符合接种的供试品体积不得大于培养基体积的10%，同时，流乙醇酸盐每管装量不少于15ml，TSB不少于10ml 适用于无法用薄膜过滤法进行无菌检查的。药品无菌检查法药品无菌检查法 混悬液等非澄清水溶液供试品混悬液等非澄清水溶液供试品 取规定量，等量接种至各管培养基中 固体供试品固体供试品 取规定量，直接等量接种至各管培养基中，或加入适宜的溶剂溶解，或按标签说明复溶后，取规定量等量接种至各管培养基中。非水溶性供试品非水溶性供试品 加入适量的乳化剂及稀释剂使其乳化再接种，或直接接
11、种至含乳化剂的培养基中 敷料供试品敷料供试品 以无菌操作拆开每个包装，于不同部位剪取约100mg或1cm*3cm的供试品，等量接种于各管足以浸没供试品的适量培养基中。肠线、缝合线等供试品肠线、缝合线等供试品 取最小包装，无菌拆开包装，等量接种于各管足以浸没供试品的适量培养基中。灭菌医用器具供试品灭菌医用器具供试品 必要时将其拆散或切成小碎段，等量接种于各管足以浸没供试品的适量培养基中。放射性药品放射性药品 取供试品1支，等量接种于装量为7.5ml的流乙醇酸盐流体培养基和TSB中。每管接种量为0.2ml。药品无菌检查法药品无菌检查法 阳性对照阳性对照 无抑菌作用及抗革兰氏阳性菌为主的-金葡 抗革
12、兰氏阴性菌为主的-大肠 抗厌氧菌的-生孢梭 抗真菌的-白念 阳性对照72小时内小时内生长良好 阴性对照阴性对照 相应的溶剂、稀释液、冲洗液同法操作，不得有菌生长 药品无菌检查法药品无菌检查法 培养及观察培养及观察 液体培养基浑浊 物理变化？化学变化？生物学变化？培养14天，逐日观察并记录，注意和阳性、阴性对比，培养14天后依然无法从外观上判断有无微生物生长，可取该培养液转种至同种新鲜培养基，培养3天，观察是否再次出现浑浊。药品无菌检查法药品无菌检查法 若明显浑浊-怎么办？1）立即转接2ml该培养物至相同的培养基中继续培养；2）取5支冻存管，每管分装1ml浑浊培养物，-80保存；3）取浑浊培养物
13、在TSA平板/血琼脂上划线，分离污染微生物；4）如果发现硫乙醇酸盐流体培养管变浑浊，还应增加血平板划线，并在厌氧条件下培养分离厌氧菌。由平板分离到的菌落应进一步鉴定，并逐一保藏。药品无菌检查法药品无菌检查法 结果判断结果判断 阳性对照生长良好，阴性不得有菌，否则试验无效 若供试品澄清，或虽然浑浊但经确证无菌生长，判供试品符合规定 若任何一管浑浊并确证有菌生长，判不符合规定，除非能充分证明试验结果无效，符合下面至少一个条件：1、无菌检查试验所用的设备及环境的微生物监控结果不符合无菌检查法的要求 2、回顾试验过程，发现有可能引起微生物污染的因素 3、供试品管中生长的微生物经鉴定后，确证是因无菌试验
14、中所使用的物品和（或）无菌操作技术不当引起的。若确认无效，应重试。药品无菌检查法药品无菌检查法 要点 一个标准的SOP，物料进场，外围消毒剂消毒表面，拆除外包装，洁净传递，风淋、紫外照射，过氧化氢灭菌等，由低级别向高级别递进，最后到达A级核心区 人员进场，合理的更衣程序，A/B级：应用头罩将所有头发以及胡须等相关部位全部遮盖，必要时戴防护目镜。应戴经灭菌且无颗粒物（如滑石粉）散发的橡胶或塑料手套，穿经灭菌或消毒的脚套，裤腿应塞进脚套内，袖口应塞进手套内。工作服应为灭菌的连体工作服，不脱落纤维或微粒，并能滞留身体散发的微粒。无菌操作技术，动作熟练，关键点的控制 实验过程的监控：环境菌，表面微生物
15、，手部微生物，对环境菌进行鉴定，建立档案，以便OOS调查，进行溯源。2015年版药典的变化年版药典的变化 主要修订点 改良马丁培养基修订为胰酪大豆胨肉汤培养基（TSB）无菌检查实验条件由“万级下的局部百级”修订为“B+A”三部药典的统一 2015年版药典的变化年版药典的变化 药典药典 2010年版年版 2015年版年版 名称 改良马丁培养基 胰酪大豆胨液体培养基 配方 蛋白胨-5.0g 胰酪胨-17.0g 酵母浸出液-2.0g 大豆木瓜蛋白酶水解物-3.0g 葡萄糖-20.0g 氯化钠-5.0g 磷酸氢二钾-1.0g 磷酸氢二钾-2.5g 硫酸镁-0.5g 葡萄糖-2.5g 目的 培养真菌 需
16、氧菌、真菌、专性和兼性厌氧菌 培养条件 23-28 20-25 培养基的变化 2015年版药典的变化年版药典的变化 意义意义 1、与国际接轨USPBP 2、培养-观察的体系改变，取消严格意义上的以真菌、细菌划分的培养，而以需氧、厌氧的培养体系来划分，是一个更加广泛，更加互补的体系。2015年版药典的变化年版药典的变化 培养基的改变导致阳性菌的培养条件改变 培养基灵敏度实验：药典2010年版2015年版培养系统1硫乙醇酸盐流体：金葡、铜绿、枯草、生孢梭菌硫乙醇酸盐流体：金葡、铜绿、生孢梭菌培养系统2改良马丁：白念、黑曲胰酪大豆胨液体：枯草、白念、黑曲2015年版药典的变化年版药典的变化 方法适用性实验：药典2010年版2015年版培养系统1硫乙醇酸盐流体：金葡、大肠、枯草、生孢梭菌（4种菌）硫乙醇酸盐流体：金葡、大肠、生孢梭菌（3种菌）改良马丁：白念、黑曲（2种菌）培养系统2胰酪大豆胨液体：枯草、白念、黑曲（3种菌）2015年版药典的变化年版药典的变化 菌种的培养条件改变 药典2010年版2015年版金黄色葡萄球菌铜绿假单胞菌枯草芽孢杆菌生孢梭菌硫乙醇酸盐流体培养基硫乙醇酸盐流体培养基白
