1、广东化工2023年 第4期第50卷 总第486期GC-MS/MS法测定利伐沙班中亚硝胺杂质法测定利伐沙班中亚硝胺杂质黄冰，曹卫明，程涛，张鑫鑫(常州制药厂有限公司，江苏 常州213018)摘要目的：建立了一种气相色谱-质谱法(GC-MS/MS)法测定利伐沙班中亚硝胺杂质(N-亚硝基二甲胺)的残留量的方法。方法：以Agilent DB-WAX(30 m0.32 mm，0.5 m)色谱柱，结合程序升温对样品进行分离，载气为高纯氮气，流速为2.0 mL/min，进样方式为分流进样，分流比为41。离子源为电子轰击离子源(EI)，溶剂延迟4 min，电压为70 eV，离子源温度为250，多反应检测模式(
2、MRM)，外标法定量，检测定量离子质荷比(m/z)为7444.10，检测定性离子质荷比(m/z)为7442.10。结果：N-亚硝基二甲胺(NDMA)在48240 ng/mL浓度范围内具有良好的线性关系，相关系数R为0.9996；NDMA在0.96 ppm、2.56 ppm、3.2 ppm和3.84 ppm四个水平加标，回收率在99.3%106.4%，相对标准偏差为0.9%3.6%；检测限为20.9 ppb，定量限为63.3 ppb。结论：该方法专属强、灵敏度好、准确度高、分析快速，可用于利伐沙班中亚硝胺杂质(NDMA)残留的检测。关键词利伐沙班；亚硝胺杂质；N-亚硝基二甲胺；MRM；气相色谱与
3、质谱联用仪中图分类号O65文献标识码A文章编号1007-1865(2023)04-0210-04Determination of Nitrosamine Impurity in Rivaroxaban by GasChromatography-mass-mass SpectrometryHuang Bing,Cao Weiming,Cheng Tao,Zhang Xinxin(Analytical Laboratory,Changzhou Pharmaceutical Factory,Changzhou 213018,China)Abstract:Obiective:A method of d
4、etermination of nitrosamine impurity residues in rivaroxaban by gas chromatography-mass-msss spectrometry wasestablished.Methods:Using Agilent DB-WAX(30 m0.32 mm,0.5 m)chromatographic column,the samples were separated by the heating of the application,thecarrier gas was high-purity helium,the flow r
5、ate was 2.0 mL/min,and the injection method was splitless,the split ratio was 41.The ion source was electron impaction source(EI),and the solvent delay was 4 min.The voltage was 70 eV and the ion source temperature was 250.Multi-reaction monitoring mode(MRM)wasadopted,the mass-to-charge ratio(m/z)of
6、 detected quantitative ions was from 74 to 44.10 for NDMA,and the m/z of detected qualitative ions was from 74 to 42.10for NDMA.Results:NDMA has a good linear relationship in the range of 48240 ng/mL,and the correlation coefficient is 0.9996.Added to 4 levels about 0.96 ppm,2.56 ppm,3.2 ppm and 3.84
7、 ppm,the recovery range was 99.3%106.4%,and the relative standard deviation was 0.9%3.6%.The detection limit is 20.9 ppb andthe quantitative limit is 63.3 ppb.Concussion:The method is specific,sensitive,accurate and fast,which can be used to the determination of NDMA residues inrivaroxaban.Keywords:
8、rivaroxaban；nitrosamine impurity；NDMA；MRM；GC-MS/MS利伐沙班(Rivaroxaban)是一种新的口服抗凝药物1，它不需要抗凝血酶参与，可直接拮抗游离和结合的Xa因子以及凝血酶原活性。主要用于择期髋关节或膝关节置换手术的成年患者，具有生物利用度高，量效关系稳定，具有高度的选择性和竞争性，出血风险低，安全性好2。自2018年7月在缬沙坦原料中检出了N-亚硝基二甲胺(NDMA)以来，陆续在其他沙坦类原料药和非沙坦类类原料药中检出了各类亚硝胺杂质(NDMA、N-亚硝基二乙胺(NDEA)等)，亚硝胺类杂质属于ICH M7(R1)3(评估和控制药物中DNA反
9、应性(致突变)杂质以限制潜在致癌风险)指南中提及的“关注队列”物质。根据世界卫生组织公布的致癌物清单，NDMA属于2A类致癌物质。因此，2019年欧盟发布EMA建议药企采取步骤避免人用药物中的亚硝胺(EMA/511347、2019)公告，2020年CFDA发布的化学药中亚硝胺类杂质研究技术指导原则(试行)，依照目前所知，亚硝胺杂质有多种产生原因，如工艺产生、降解和外来污染等4。NDMA是一种常见亚硝胺类物质，在水中和食物中，包括熏肉和烤肉、奶制品和蔬菜中均有发现，所有人均会暴露于一定水平的NDMA。目前，NDMA暂时可接受摄入量为96 ng/天。长期暴露于高出可接受水平的致突变性致癌物如NDM
10、A可能会增加患癌风险，但持续70年每天服用含有等于或低于可接受水平NDMA的药品的人并不会增加患癌风险，利伐沙班最大日服用剂量为30 mg，根据NDMA可接受摄入量为96 ng/天可以得出，NDMA在利伐沙班中最大允许限度为3.2 ppm(96 ng/天)/(30 mg/天)=3.2 ppm)。目前尚无利伐沙班中NDMA检测的相关报道，但在其它产品中有NDMA的相关报道5-10。参照相关报道，本文建立了一种检测利伐沙班中NDMA的GC-MS/MS方法，并用于其质量控制。1仪器与方法仪器与方法1.1仪器与试剂气相色谱-质谱联用仪(岛津，SHIMADZU GCMS-TQ8040NX，EI源)；分析
11、天平(梅特勒托利多，METTLER TOLEDOMS105)；二甲基亚砜(DMSO；厂家：TEDIA，级别：HPLC)；N-亚硝基二甲胺(NDMA，厂家：TCI，含量：99.9%)；利伐沙 班(常 州 制 药 厂 有 限 公 司，批号：RB-705-201101、RB-705-201102、RB-705-201103)。1.2溶液配制1.2.1空白溶液精密量取二甲亚砜2.0 mL，置于20 mL的顶空瓶中，加盖密封。1.2.2供试品溶液精密称取供试品约100 mg，置于20 mL的顶空瓶中，精密量取二甲亚砜2.0 mL于顶空瓶中，加盖密封，振摇混匀。1.2.3对照品储备液精密称取NDMA对照品
12、约50 mg，置于50 mL量瓶中，用二甲亚砜溶解、混匀，并定容至刻度，得NDMA标准储备；精密量取NDMA标准储备液160 L，置于100 mL量瓶中，用二甲亚砜混匀，并定容至刻度，摇匀。1.2.4对照品溶液精密量取对照品储备液5.0 mL，置于50 mL量瓶中，用二甲亚砜混匀，并稀释至刻度。精密量取上述溶液2.0 mL，置于20 mL的顶空瓶中，压盖密封。1.2.5 3.2 ppm水平加标供试品溶液精密称取供试品约100 mg，置于20 mL顶空瓶中，精密量取的对照品溶液2.0 mL于顶空瓶中，加盖密封，振摇混匀。1.3色谱条件色谱柱：Aglient DB-WAX(30 m0.32 mm，
13、0.5 m或效能收稿日期2022-08-13作者简介黄冰(1985-)，男，湖北武汉人，硕士研究生，主要研究方向为药物分析。2023年 第4期广东化工第50卷 总第486期211相当的色谱柱)；顶空温度：120；采样线温度：150；传输线温度：155；顶空保温时间：20 min；进样时间：1 min；隔垫吹扫：6 mL/min；进样针吹扫时间：10 min；GC循环时间：30 min；顶空加压压力：105 kPa；载气为高纯氦(纯度99.999%)；进样模式：分流进样，分流比：41；柱流速：2mL/min；采集时间：4.505.40 min；梯度升温程序：初始柱温40，保持0.5 min，以2
14、0/min的速度升温至240，保持5 min。1.4质谱条件离子源：电子轰击离子源(EI)；检测器电压：相对调谐电压为+0.6 kV；离子源温度：250；接口温度：250；采集模式：MRM(选择离子监控模式)；定量离子：44.10，前提离子：74.00，碰撞电压6 V；定性离子42.10，前提离子74.00，碰撞电压18 V。2试验结果试验结果2.1方法参数优化在质荷比40500范围内，通过对待测化合物N-亚硝基二甲胺(NDMA)进行全扫描(一级质谱)，从它的一级质谱中选取峰高相对较高、质荷比较大的离子作为特征母离子(74.00)；在确认好母离子(74.00)的前提下，通过调节二级质谱中的碰撞
15、电压，优化碰撞能量，得到信噪比较强的离子(44.10和42.10)，将其作为定量离子(44.10)和定性离子(42.10)。优化后的母离子和子离子最佳碰撞能量见表1。表表1N-亚硝基二甲胺亚硝基二甲胺(NDMA)的质谱参数的质谱参数Tab.1MS parameters of NDMA化合物定量离子碰撞电压/V定性离子碰撞电压/V检测模式NDMA74.0044.10674.0042.1018MRM2.2方法学研究与验证2.2.1专属性试验分别取空白溶液、对照品溶液(连续进样6针)、供试品溶液和加标供试品溶液(3.2 ppm水平)分别进样。空白溶液不干扰NDMA的测定，连续6针对照品溶液色谱图中N
16、DMA峰面积的RSD为2.2%。典型谱图见图14。图图1空白溶液色谱图图空白溶液色谱图图2对照品溶液色谱图对照品溶液色谱图Fig.1Chromatogram of blank solutionFig.2Chromatogram of standard solution图图3供试品溶液色谱图图供试品溶液色谱图图4加标供试品溶液色谱图加标供试品溶液色谱图Fig.3Chromatogram of sample solutionFig.4Chromatogram of sample spike solution2.2.2线性及检测限定量限试验线性溶液：依次测定NDMA浓度分别为48 ng/mL、80 ng/mL、128 ng/mL、160 ng/mL、192 ng/mL、240 ng/mL，以浓度为横坐标，定量离子的峰面积为纵坐标进行线性拟合。检测限(LOD)和定量限(LOQ)测试溶液：精密量取二甲亚砜2.0 mL，置于20 mL的顶空瓶中，加盖密封，平行配制10份。连续进样10份空白溶液，通过基于响应值标准偏差和标准曲线斜率法计算检测限和定量限。计算公式如下：LOQ计算方法：10LOQS=L
