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DNA加合物组的预处理及检测方法研究进展_李昕冉.pdf

上传人:哎呦****中 文档编号:209990 上传时间:2023-03-08 格式:PDF 页数:7 大小:1.54MB
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资源描述

1、 基金项目:国家自然科学基金(、);江苏省市场监督管理局科技计划项目();国家药品监督管理局化学药品杂质谱研究重点实验室开放课题();同为通信作者 作者简介:李昕冉,女,研究方向:药物分析研究,:通信作者:郭娜,女,主管药师,研究方向:药品检验,:,:;吴春勇,男,教授,博士生导师,研究方向:药物分析研究,:,:加合物组的预处理及检测方法研究进展李昕冉,孙铜,郭娜,张峻颖,吴春勇,(中国药科大学药物质量与安全预警教育部重点实验室,江苏 南京;中国药科大学药物分析教研室,江苏 南京;山东省食品药品检验研究院,山东 济南;济南市食品药品检验检测中心,山东 济南;中国药科大学中药制剂教研室,江苏 南

2、京)摘要:加合物为亲电性物质与 共价结合形成的一类 损伤,若不能及时修复可能会引发癌症。具有高灵敏度、高选择性的液质联用技术已成为 加合物检测的主流方法。加合物组学能同时测定复杂生物基质中多种已知的 加合物,扫描和鉴定未知 加合物,因此可以更全面的阐释遗传毒性物质的毒性。虽然近年来在 水解、加合物纯化富集、液相分离、质谱扫描策略和数据处理等方面不断优化,加合物组学检测仍面临着巨大的挑战。关键词:加合物;遗传毒性;水解;液质联用中图分类号:文献标识码:文章编号:():,(,;,;,;,;,):,:;近年来,缬沙坦、雷尼替丁和二甲双胍等已上市药物中意外发现遗传毒性杂质引发了人们的极大关注。研究发现

3、,遗传毒性物质广泛存在于环境中,譬如汽车尾气、香烟、烧烤中的 氨基联苯、苯并芘等多种多环芳烃、真菌产生的黄曲霉素、染料中 萘胺、马兜铃酸和他莫昔芬等。除了外源性暴露,内源性因素如脂质过氧化产生的低分子量醛类也能造成遗传毒性。加合物是导致遗传毒性的重要原因之一。所谓 加合物,是指暴露于外源或内源的亲电性物质或经代谢激活后具有亲电性的物质与 亲核位点共价结合形成的药学研究 .1,.1化合物。若不能及时修复损伤,修饰核苷酸可能会妨碍正常的未修饰核苷酸配对,从而导致碱基的错配、置换;大体积的修饰物或 链内交联可能使 链扭曲甚至断裂,干扰 复制和 转录。原癌基因、抑癌基因等重要基因的突变以及突变蛋白引起

4、的表型改变在肿瘤的发展过程中具有重要作用,。因此,加合物被认为是癌症的早期生物标志物以及必要不充分条件。加合物的形成许多致癌物都需要代谢激活才能 反应形成 加合物,譬如苯并芘()、萘胺()、硝基苯并蒽酮()、氨基,二甲基咪唑并,喹喔啉()、氨基 甲基咪唑并,喹啉()等多环芳烃或芳香胺、亚硝基二甲胺()和 亚硝基二乙胺()等亚硝胺类物质、二氯甲烷和二氯乙烷等烷基卤化物、马兜铃酸等。相和 相代谢酶在遗传毒性物质代谢中的作用是复杂的,体内 酶的解毒与代谢激活作用并存,代谢平衡影响其遗传毒性。相比 中其他位点,碱基加合物的发生频率更高。修饰物最常加合在碱基的氮氧原子、嘌呤的 原子以及嘧啶的 和 上(见

5、图)。由于亲核性最高,鸟嘌呤的(如黄曲霉素 的加合物)和腺嘌呤的 是最易被攻击的位点,且位于 双螺旋大沟中的鸟嘌呤 比位于小沟的腺嘌呤 位点更容易形成加合物。多环芳烃、芳香胺等遗传毒性物质更多加合在嘌呤的 位(如氨基联苯的加合物)。乙醛、巴豆醛等醛类物质还可以与鸟嘌呤的 和环外氮成环(如形成加合物,)。氮芥()形成单加合物后又形成了新的亲电中间体(),可以与蛋白质亲核侧链反应产生蛋白质交联或攻击另一个碱基形成链内或链间交联。图 常见的 反应位点及 加合物,加合物的分析方法 加合物的发生频率很低,个核苷中才会产生一个加合物,因此加合物分析极具挑战性。后标记法曾经是最常使用的检测方法,可以检测到

6、个加合物个碱基。但后标记操作烦琐,不同加合物的酶解和 标记效率不同,重现性较差,放射性元素的使用也大大限制了此法的使用,。免疫分析方法利用抗原抗体的特异性结合,将加合物的定量信息转化为荧光或放射信号,可对加合物进行原位分析,观察其在组织或细胞中的分布。免疫分析不需要酶解,操作简便,结合校正曲线可实现加合物的半定量。但此法所需的样品量较大,需要有待测加合物对应的特异性抗体,可能存在的交叉免疫反应也会出现高估情况。液质联用法具有优秀的选择性以及与 后标记法相当的灵敏度,加之能提供加合物的结构信息,近来已成为 加合物最广泛使用的检测方法,。提取的 进行水解,得到 脱氧核苷混合物,经液相分离后进入质谱

7、检测器,由于含有能量较低的糖苷键,容易失去 脱氧核糖部分(),从而发生(高分辨率 )的中性丢失,利用这一特征可对加合物进行定性定量分析。有的 加合物在热解或中度酸性条件下稳定性较差,碱基易从加合物上脱落,质谱分析还可以对碱基的中性丢失进行扫描,。已知 加合物的检测可以根据其分子量、热稳定性等性质,设计具体的靶向检测方案。然而,环境中的遗传毒性物质来源复杂,仅从个别 加合物的角度解释其与特定肿瘤之间的关系可能并不全面,有必要同时检测多个已知或未知的 加合物,筛查潜在的遗传毒性物质。“组学”能从整体角度研究机体变化,其概念早已运用于基因组学、蛋白组学和代谢组学,也适用于 加合物的检测。等以此法在香

8、烟浸出物孵育的卵泡细胞()中鉴定出 种与苯并芘和 氨基联苯有关的 加合物。加合物组学可以通过同时检测多个已知或未知的 加合物水平来预测遗传毒性风险,加深 加合物在肿瘤发展进程作用的理解,未来很可能成为比单一加合物更可靠的生物标志物。液质联用 加合物组的研究进展液质联用法检测 加合物,首先需要将 从待测样本中提取出来,水解成单核苷,经过富集纯化后使用液质联用法对加合物进行检测,其中每个步骤都可能影响到分析结果,譬如不同的提取方法影响 的纯度和得率,在线富集可以减少离线纯化加合物的损失,不同溶剂富集加合物效药学研究 .1,.1果以及引入的基质效应各有不同,甚至不同品牌的玻璃内衬管也会影响样品的清洁

9、度和提取回收率,。水解目前直接分析 链和寡核苷酸上甲基以外的修饰物或其他 结构变化还较为困难,研究者可以通过核酸酶、酸或热等手段将 水解为易于分析的小分子,不过水解的同时也丢失了加合物在 序列中的位置信息。甲酸或盐酸配合 的高温是常用的 酸水解方法,等将 细胞和 细胞用致癌性烷基化试剂 甲基亚硝基脲()、甲磺酸甲酯()和 甲基亚硝胺基吡啶基丁酮()孵育,然后从细胞中提取 加入 的盐酸,酸水解,测得的烷基化核苷加合物的浓度 小于。然而,高温和酸性条件有较大的降解风险,相较而言,酶解条件更加温和,因此更常用于 的处理(见表)。表 液质联用 加合物检测常用的 水解酶种类、孵育浓度及时间遗传毒性物质文

10、献 微球菌核酸酶核酸酶 磷酸二酯酶磷酸二酯酶 碱性磷酸酶马兜铃酸(,)(,)(,)(,)烷基化氮芥前药();(过夜,;过夜,)(过夜,)(过夜,)巴豆醛(),()()食物中含有的致癌物如 等,(,)(,)(,)(,)多种芳香胺或多环芳烃,(,)(,)(,)(,)环丁烷嘧啶二聚体()和嘧啶()嘧啶酮光产物()(过夜)(过夜)(过夜)烯丙基苯甲醚()(,)(,)(,)(,)奥沙曲霉毒素()(,)(,)(,)(,)黄樟醚()、苯并芘(),(,)(,)(,)丁香酚()(,)(,)(过夜,)芥子油苷()(,)(,)(,)乙醛(,)(,)(,)注:除另有说明,酶用量单位为;脱氧核糖核酸酶 (牛胰腺 );核

11、酸酶(橘青霉菌,);磷酸二酯酶(蛇毒,);磷酸二酯酶(牛脾,);重组酶(大肠杆菌,)。括号中的时间表示不同核酸酶的孵育时间;、表示不同核酸酶的孵育顺序。碱性磷酸酶(大肠杆菌,);来源未知;碱性磷酸酶(牛小肠,);蛋白 磷酸二酯酶可酶解核苷酸之间的磷酸二酯键,是 水解过程中常用的核酸外切酶。磷酸二酯酶()的酶解方向为 到,将 核苷酸游离出来。磷酸二酯酶()酶解方向则相反,酶解产物为 核苷酸。常与脱氧核糖核酸酶()和核酸酶()配合使用,其中 的作用是将长链 酶解成寡核苷酸,则是酶解寡核苷酸和单链,有些序列的 具有磷酸二酯酶抗性,无法完全水解寡核苷酸,加入 有助于寡核苷酸完全水解;则常搭配非特异性核

12、酸酶微球菌核酸酶(),;两种磷酸二酯酶有时也会同时使用。为了便于质谱分析,生成的核苷酸还要经过碱性磷酸酶()水解为核苷。动物来源的 较为复杂,研究发现 是加合物检测中引起背景干扰和基质效应的重要因素之一。等,将 酶解方案中的 用量降低或者换成纯度更高的重组内切酶,发现上述问题得到了很大改善。此外,来自不同品牌的核酸酶也可能影响 加合物的检测,来自 和 两个品牌的 具有不同的脱氧腺苷脱氨酶活性和 磷酸酶活性,可能对碱基上含有裸露环外氨基的加合物有不同影响。不论是酸水解还是酶解,应考虑处理过程中 加合物的稳定性。为更好保证结果的可靠性,最好有同位素标记的加合物内标进行校正。液相色谱条件 十八烷基硅

13、烷键合硅胶为填充剂的色谱柱在 加合物及 加合物组学的分析中最为常用,。此外,等使用酰胺柱分离了 种烷基化修饰核苷和未修饰核苷。等则使用氨基甲酰基键合的亲水相互作用色谱()柱,将有机相比例提高到,从而提高电喷雾离子源()的离子化效率。等,以巴豆醛或丙烯醛的 加合物为对象,比较了液质色谱法中常用的流动相添加剂对 加合物质谱响应的影响,发现与甲酸铵、乙酸铵和甲酸相比,流动相中加入碳药学研究 .1,.1酸氢铵后的检测灵敏度最高,推测碳酸氢铵抑制了质谱响应较差的金属阳离子 加合物的形成,且 在离子源中降解形成 和水,有利于加合物的质子化。等发现高比例有机溶剂(乙腈)的流动相中加入碳酸氢铵,也可以提高乙基

14、加合物和巴豆醛加合物的质谱响应。有研究报道乙腈作为流动相质谱响应高于甲醇,但甲醇洗脱能力弱于乙腈,达到相同的保留时间所需的有机相比例更高,有机相的选择还需针对具体情况进行优化。电离效率随着流速降低而提高,将色谱柱内径减小至毛细管尺寸,流动相流速降低至以 为单位(),与特制的微米级甚至纳米级离子源()配合,产生更小的初始液滴,可以提高电离过程中的去溶剂作用,而且更小的液滴包含更少的待测物,减少了待测物电荷之间的聚集和竞争,可以极大提升检测灵敏度。等使用 分析了前列腺癌症患者切除的前列腺中的 加合物,采用 ,定量限为 个加合物个核苷。等换用 离子源,将分析灵敏度在原有方法的基础上提高了 倍。质谱扫

15、描模式 除了靶向检测待测 加合物或利用中性丢失扫描模式()筛选未知 加合物外,还有许多基于中性丢失原理优化和发展而来的质谱扫描模式(图)。等使用电喷雾串联质谱的多反应监测模式(),在 的范围内检测了 个离子对,该模式也称伪中性丢失模式(),符合条件的离子结合人工筛选、稳定同位素稀释以及与对照品比较,确认了吸烟者肺组织中多个氧化加合物的存在。模式需要多次进样,但其灵敏度优于 模式。譬如,在 消化前掺入相同量的加合物对照品,采用扫描 个离子对的 模式,加合物 的检测灵敏度是 模式的 倍,而加合物 在 模式下甚至无法检出。单个离子扫描时间越多,色谱峰越平滑,背景信号越低,因此需要平衡检测的离子对数与

16、进样次数。需要注意的是,仅依靠 中性丢失的特征不足以确定色谱峰对应成分就是 加合物,通过 模式和 模式发现的 加合物仍需进一步进行鉴定。等率先使用线性离子肼质谱()对产生 中性丢失的产物离子进行三级扫描(),发现此法可以提供更多的结构信息。等改用 高分辨质谱,为 加合物鉴定提供了更有利的支持。受限于现有仪器扫描速度不足,模式无法扫描所有离子,数据采集更倾向于丰度较大的离子,导致低丰度加合物的信息丢失。与此相比,数据非依赖型采集模式()不依赖离子丰度,可以无偏向的收集目标 范围内的所有母离子()及 其 光 谱。蛋 白 质 组 学 中 的()扫描模式将 扫描分割成更小的窗口,简化了复杂的 数据处理,同时提高 的质量。等借鉴并优化了 扫描模式,将 扫描分为宽度为 扫描窗口(),成功用于 加合物组学的检测,提高了母离子和碎片离子的检测灵敏度。该扫描方式不仅可以检测以糖基中性丢失为特征的 加合物,还可以在不重新进行数据采集的情况下挖掘丢失碱基或其他质谱碎裂模式的 加合物相关信息。数据处理 等开发了一种新的检测算法,结合碎片过滤的开源软件,建立了一个筛选和推定 加合物的自动化数据分析流程,减少了数

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