1、2023年2月第29卷第2期February.2023 Vol.29 No.2胶类中药在我国有悠久的应用历史，按原料来源不同主要分为皮胶类、骨胶类、角胶类、甲胶类，有补血、止血、祛风、调经、滋补等作用1。皮胶类中药由动物皮为原料煎取胶液浓缩制成，如阿胶、黄明胶分别是以驴皮、牛皮经漂泡去毛，煎煮，加辅料黄酒、冰糖、豆油等浓缩制成的固体胶2-3。原料皮中主要含有胶原蛋白，如驴皮的主要组成为胶原蛋白1型、胶原蛋白2型及血清白蛋白4。在化胶过程中，受高温高热影响，蛋白质发生降解后产生多种蛋白多肽。由驴皮制成的阿胶是多种蛋白成分降解的混合物。有研究通过凝胶电泳结合高分辨率质谱技术对阿胶蛋白质组学进行研究
2、，检出316种可识别蛋白，其中主要为核心蛋白聚糖、双糖链蛋白聚糖、纤调蛋白等富含亮氨酸的小分子蛋白聚糖以及免疫球蛋白、胶原蛋白等多种活性蛋白5；此外，阿胶还含有糖类、氨基酸、多不饱和脂肪酸6、脂质和微量元素7。阿胶具有益智、美容8、抗氧化9、提高免疫力10等功效。研究11表明，不同动物皮胶具有与阿胶不同的功效。如 本草纲目 载：“胶有三种：清而薄者画家用；清而厚者名覆盆胶，入药用；浊而黑者不入药，但可胶物尔凡造诸胶，自十月至二三月间，用沙牛牛、水牛、驴皮者为上，猪、马、骡、驼皮者次之，其旧皮、鞋、履等物者为下。”12黄明胶具有润肠通便、抗疲劳、补血的作用13，“同葱白同煮，通大便”14，可治“
3、一切痈疽肿毒，治血止痛润燥，利大小肠，皆取其有滋益之功，无滑利之患”15-16。以往研究多采用蛋白质电泳SDS-PAGE凝胶电泳对驴皮胶及常见伪品胶中的蛋白分析研究*张小慧，王世伟，席啸虎，李志强（山西省中医药研究院，山西太原030012）摘要目的：研究驴皮胶及常见伪品胶马皮胶和牛皮胶的蛋白凝胶电泳行为。方法：自制3种皮胶，计算出胶率，BCA蛋白浓度测定试剂盒测定其蛋白含量，计算上样量，使上样量为2030 g。垂直电泳仪进行SDS-PAGE凝胶电泳，采用考马斯亮蓝及银染法显色。结果：3种皮胶的凝胶电泳行为相似，蛋白成分主要集中在分子量大于25 kDa段上，银染法灵敏度更高，可显示较多条带。结论
4、：3种皮胶分子量分布宽泛，具有共同的条带，进一步可用多肽蛋白质谱鉴定技术对各混合物组分进行更深入分析。关键词驴皮胶；牛皮胶；马皮胶；SDS-PAGE凝胶电泳；蛋白质中图分类号R284.1文献标识码A文章编号1672-951X（2023）02-0047-03DOI：10.13862/43-1446/r.2023.02.009Analysis of Protein in Gonkey-hide Glue and Common False Glue bySDS-PAGE Gel ElectrophoresisZHANG Xiaohui,WANG Shiwei,XI Xiaohu,LI Zhiqian
5、g(Shanxi Province Academy of Traditional Chinese Medicine,Taiyuan Shanxi 030012,China)AbstractObjective:To study the protein gel electrophoretic behavior of donkey-hide glue and commonfake glue such as horse-hide glue and cow-hide glue.Methods:Three kinds of hide glue were prepared,theglue rate was
6、calculated,the protein content was determined by BCA protein concentration determination kit,and the sample loading was calculated to make the sample loading 2030 g.SDS-PAGE gel electrophoresiswas performed by vertical electrophoresis apparatus,and color was developed by Coomassie brilliant blue and
7、silver staining.Results:The gel electrophoresis behaviors of the three kinds of hide glue were similar.The proteincomponents were mainly concentrated on the segments with molecular weight greater than 25 kDa.The silverstaining method was more sensitive and showed more bands.Conclusion:The molecular
8、weight distribution ofthe three kinds of hide glue is broad,and they have common bands.The peptide protein mass spectrometry canbe used to further analyze the components of each mixture.Keywordsdonkey-hide glue;horse-hide glue;cow-hide glue;SDS-PAGE gel electrophoresis;protein引用：张小慧，王世伟，席啸虎，李志强.SDS-
9、PAGE凝胶电泳对驴皮胶及常见伪品胶中的蛋白分析研究J.中医药导报，2023,29(2):47-49.*基金项目：山西中医药大学科技创新能力培育计划（2019PY-137）；山西省科学技术厅面上青年基金项目（201801D221389）472023年2月第29卷第2期February.2023 Vol.29 No.2法分析不同种胶17-18，蛋白质电泳为弥散状态，且原料来源差异大的胶类分子量有明显差异。为进一步研究驴皮胶及其常见伪品胶（如牛皮胶、马皮胶）的蛋白组成分布并避免辅料的干扰，本研究采用SDS-PAGE凝胶电泳技术，对未添加辅料的常见3种动物皮胶（驴皮胶、牛皮胶、马皮胶）进行分析，用不
10、同灵敏度的染色方法，如考马斯亮蓝染色或快速银染法判断凝胶电泳结果，以明确3种动物皮胶凝胶电泳的蛋白质分布情况。1材料与仪器1.1材料驴皮（产地：山西榆社）、马皮（产地：内蒙古）、牛皮（产地：山西汾阳）各4批，为完整皮张取下的样品，由山西省榆社阿胶厂驴皮提供商李晓蒙鉴定；BCA蛋白浓度测定试剂盒（SEVEN BioTECH，批号：SW101-02）；SDS-PAGE凝胶快速配制试剂盒（江苏凯基生物技术股份有限公司，批号：KGP113K）；SolarFast SDS-PAGE考马斯亮蓝染色液（Solarbio公司，批号：G4540）；快速银染试剂盒（批号：P0017S）、5SDS-PAGE蛋白上样
11、缓冲液（批号：P0015）均购自碧云天生物技术有限公司；X-biotech彩色预染蛋白质分子量标准（10180 kDa，安徽欣伯玉生物科技有限公司，批号：190524）；过硫酸铵（Sigma公司，批号：A3678）；1PBS（0.01mol/L，pH值：7.27.4）（森贝伽生物技术有限公司，批号：BC-BPBS-01）；十二烷基硫酸钠（SDS）（批号：A100227）、三羟甲基氨基甲烷（Tris）（批号：A600194）、甘氨酸（Glycine）（批号：A610235）均购自生工生物工程股份有限公司。1.2仪器HI微孔板检测仪（美国BioTek公司）；221BR垂直电泳仪（美国BioTek公
12、司），FluorChem HD2型凝胶成像仪（美国Protein Simple公司）；BP-310S电子天平（德国赛多利斯）。2方法与结果2.1驴皮胶、马皮胶、牛皮胶的制备取以上3种动物皮（每种皮4批）各1 kg，反复清水浸泡，用刀刮去毛发，除去皮下油脂及筋膜。称取湿皮500 g，剪成大块，放入熬胶专用锅，加水3 000 mL，大火使沸腾，撇去浮沫后转为小火慢熬24 h，除去带毛发的皮层，倾出，1 500 r/min离心15 min，取上清液，搅拌浓缩至200 mL，倒入锡箔纸上，105 干燥5 h，称干胶质量，计算得率，各动物皮出胶率及蛋白含量见表1。表 1样品出胶率及蛋白含量测定结果皮胶种
13、类湿皮质量（g）干燥所得质量（g）出胶率（%）蛋白含量（%）驴皮胶15001352774驴皮胶25001102264驴皮胶35001202466驴皮胶45001202466马皮胶15001152362马皮胶25001052161马皮胶35001252566马皮胶45001152366牛皮胶15001102261牛皮胶2500851750牛皮胶35001002056牛皮胶45009018532.2BCA法测定各动物皮胶的蛋白浓度2.2.1BCA工作液配制按BCA蛋白浓度测定试剂盒操作方法将试剂A和试剂B按照501的体积比混合，配成BCA工作液。2.2.2BSA蛋白标准曲线的绘制取20 L 5 m
14、g/mL的BSA蛋白标准溶液用PBS溶液稀释至100 L，使其质量浓度为1.0 mg/mL；分别取1.0 mg/mL BSA标准溶液0、0.5、2.5、5.0、10.0、15.0、20.0L，另取5.0 mg/mL BSA标准溶液6.0、8.0 L，并用PBS溶液分别补足到20 L，分别制成BSA质量浓度为0、25、125、250、500、750、1 000、1 500、2 000 g/mL的蛋白标准品溶液；向微孔板中加入200LBCA工作液，混匀，37放置30min，测定562 nm处的吸光值，以不含BSA样品的光吸收值作为空白对照。以A562吸光度（y）为纵坐标，BSA含量（x）为横坐标，
15、绘制标准曲线，得回归方程y=0.016 3x+0.038，r=0.998。2.2.3样品含量测定称取干燥的皮胶约10 mg，精密称定，PBS溶液稀释至800 L，取稀释液20 L，加入BCA工作液200 L，充分混匀，37 孵育30 min，测定562 nm处的吸光值，计算蛋白含量，结果见表1。3类皮胶都含有较高的蛋白成分，驴皮胶蛋白成分最多，含量为64%74%。2.3SDS-PAGE凝胶电泳技术分析驴皮胶、马皮胶及牛皮胶2.3.1SDS-PAGE胶的配制按照SDS-PAGE凝胶快速配制试剂盒说明配制分离胶与5%的浓缩胶，灌胶。2.3.25电泳缓冲液的配制称取Tris 15.1g，Glycin
16、e 94 g，SDS 5 g，用蒸馏水溶解至1 000 mL，室温保存，用时稀释5倍。2.3.3电泳将样品稀释至合适浓度，保证上样蛋白量为2030 g，加5SDS-PAGE蛋白上样缓冲液适量，点样，垂直电泳仪电泳，电泳结束后，取出胶框，剥去玻璃板。2.3.4染色考马斯亮蓝染色液染色法：将电泳后的PAGE胶放入塑料容器中，加入适量染色液覆盖胶块，置于摇床上摇动。12 min后条带开始显现，随着时间延长，染色条带加深。快速银染法：将凝胶放入固定液中，摇床上室温摇动20 min。固定液的配制：依次加入50 mL乙醇、10 mL乙酸和40 mL Milli-Q级纯水或双蒸水。固定40 min后，弃固定液，依次用30%乙醇、Milli-Q级纯水摇床摇动10 min洗涤；弃水、加入银染增敏液增敏，再次用Milli-Q级纯水洗涤2次；弃水，加入银溶液银染10 min，水洗涤；弃水，加入银染显色液进行显色至出现蛋白条带，弃银染显色液，加入银染终止液；弃银染终止液，加入Milli-Q级纯水保存，凝胶成像仪拍照。考马斯亮蓝染色结果显示：3种皮胶整体分子量呈弥散状态，随着分子量减小，染色颜色变浅，17 kD
