1、，.，.基金项目：国家自然科学基金（；）；国家重点研发计划（）（，），（）；：.基于石墨烯 氯化血红素复合物纳米酶可视化检测谷胱甘肽范存霞，谷 雨，邱星晨，李长明，郭春显，苏州科技大学物理科学与技术学院，江苏 苏州 苏州科技大学材料科学与工程学院，江苏 苏州 苏州科技大学环境科学与工程学院，江苏 苏州 纳米酶是一类具有类酶催化活性的纳米材料，与天然酶具有相似的尺寸、形状和表面电荷等，但更易于制备、且价格低廉、稳定性好、有望成为天然酶的替代品，在生物分析、成像、治疗、环境保护等方面具有广阔的应用前景。石墨烯（，）由于比表面积较大、导电性及热导率高、力学性能好、晶格缺陷较少以及表面功能性官能团丰富
2、等特点，在二维催化剂的载体方面有广阔的应用前景。本工作通过石墨烯与氯化血红素（）的自组装制备了一种具有纳米酶活性的纳米复合材料 。该复合材料保留了石墨烯比表面积大的特征，且在酸性条件下，可以催化氧分子生成自由基（），从而将，四甲基联苯胺（）氧化。基于体系中谷胱甘肽（）与 氧化的竞争关系，建立了一种快速，高灵敏度的可视化检测 检测方法。使用该方法时 处的紫外吸光度与谷胱甘肽浓度在 范围内呈现良好的线性关系，检测限为 ，肉眼可识别的谷胱甘肽最低浓度为 。该方法可实现对血清中 的简单、快速、高选择性的检测，在临床检测中有广阔的应用前景。关键词 谷胱甘肽 石墨烯 四甲基联苯胺 可视化检测中图分类号：文
3、献标识码：，（），（），（），引言酶是一种具有优异催化活性和选择性的生物催化剂，能够在温和的条件下催化各种反应。然而天然酶的成本高、难以制备和纯化、易失去活性以及难以循环利用等特点限制了其实际应用。为了克服天然酶一些固有的缺点，科研人员一直致力于开发催化活性强且性能稳定的天然酶替代物。年，等发现金锌纳米簇具备优异的催化性能，该材料同时具备纳米材料和模拟酶的特性，因此他们首次提出了“纳米酶”这一概念。相较于天然酶，纳米酶具有制备简单、成本低、稳定性高、催化活性可调节及易于与生物分子结合等优点，具有很大的开发潜力。随着纳米科技的快速发展，研究发现一些纳米材料本身就具有类酶活性，如金属氧化物（、）、
4、贵金属（、）、碳基材料（碳纳米管、碳量子点）等。碳基纳米酶具有成本低、稳定性高以及生物相容性好等特点，受到越来越多的关注。最早在 年，等发现富勒烯以及富勒烯的衍生物具有纳米酶活性，可以作为超氧化物歧化酶的模拟物。随后越来越多的碳材料被发现具有纳米酶活性，如石墨相氮化碳、碳纳米管、碳量子点等。等发现石墨烯氧化物同样具有纳米酶活性，可在存在过氧化氢的情况下催化氧化底物分子。然而碳材料固有类酶活性较低，因此开发高性能的碳基纳米酶具有广阔前景。研究表明，对碳材料进行表面功能化可以显著提高材料的催化活性。例如，等在富勒烯表面引入羧基制备了具有更高纳米酶活性的纳米酶，建立了一种新型的葡 萄糖比色传感器。等
5、在氨基修饰的单壁碳纳米管负载血红素，合成了一种具有高效催化性能的 用于检测过氧化氢和葡萄糖。与其他检测方法如电化学、免疫发光、高效液相色谱、质谱法等相比，碳基纳米酶检测体系克服了仪器昂贵、操作过程复杂且耗时以及合成步骤繁琐等缺点，在生物分子检测方面有广阔的应用前景。石墨烯因比表面积较大、导电性及热导率高、力学性能好、晶格缺陷较少以及表面功能性官能团丰富等特点，在二维催化剂载体方面有广阔的应用前景。等通过等离子体处理技术，在室温下将 掺杂到石墨烯中，成功制备了类酶活性提高近五倍的 掺杂石墨烯，并基于复合材料的纳米酶活性建立了一种比色法以检测牛奶中的，该传感平台有较宽的线性范围，检测限为 。等制备
6、了、共同掺杂的多孔碳纳米酶，其类酶活性比 掺杂碳纳米酶还要高出 倍，同时利用纳米酶的催化活性建立了一种比色传感平台用于检测抗坏血酸，其检测限为 。尽管石墨烯本身酶活性并不高，但以石墨烯为平台负载其他颗粒后可得到较高纳米酶活性的复合材料，这些复合材料可广泛应用于能量存储、水处理、生物医学和诊断治疗等方面。谷胱甘肽（）是细胞内含量最丰富的一种含硫三肽非蛋白硫醇，在各个生理过程中起着关键作用，许多临床疾病与其表达水平的异常相关。目前除液相色谱法、质谱法、电化学等检测手段外，基于荧光探针设计的 检测方法也已成熟。等利用 建立了比率荧光探针，该荧光探针在 内对 有良好的响应，检测限为 。等在碳点的基础上
7、以柠檬酸、聚醚酰亚胺和罗丹明 为前驱体，开发了荧光探针，其荧光强度比值与 浓度在 内成正比，检测限为 。除金属有机框架和无机纳米荧光探针外，还有不少花菁类、苯并噻唑、萘酰亚胺和有机荧光探针也被设计用于 的检测。开发简便、灵敏度高、选择性好的谷胱甘肽传感方法尤为重要。相较于荧光探针，比色法的操作更简单、成本更低廉且检测灵敏度和选择性更好，在满足生物传感和临床需求方面具有广阔的应用前景。本工作利用氯化血红素对石墨烯进行非共价键功能化，通过非共价键实现两者间的自组装，制备了具有更高、更稳定纳米酶活性的复合材料 （该材料可在酸性条件下直接催化 氧化生成蓝绿色的氧化产物），并利用 对该反应的竞争机制，建
8、立一种简单、选择性好和灵敏度高的 检测方法。该工作在开发高催化活性纳米酶和快速、可视化检测 方面具有广阔的应用前景。实验 试剂与仪器主要试剂：石墨烯（南京先丰纳米）、，四甲基联苯胺，氯化血红素、乙酸、乙酸钠、甲基吡咯烷酮、异丙醇均为分析纯，购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。主要仪器：离心机（德国艾本德、）、磁力搅拌器（德国）、超声分散仪（昆山舒美超声仪器有限公司，）、冷冻干燥机（，）、紫外可见光分光光度仪（日本岛津）、透射电镜（，美国 ，用于观测材料形态和粒径大小）、射线光电子能谱（，美国，对材料的元素进行分析）、拉曼光谱仪（，德国 ）、傅里叶红外光谱仪（，美国 ）、液相色谱仪（美国 ）。纳
9、米复合材料的制备本工作采用自组装法制备石墨烯 氯化血红素纳米复合物（）。称取 石墨烯分散在 异丙醇中，配制成 浊液。称取 氯化血红素溶解在 甲基吡咯烷酮中，配成 的氯化血红素溶液。取 石墨烯异丙醇浊液和 氯化血红素溶液混合置于含转子的避光玻璃瓶中，加入一定量的异丙醇混匀（使更分散均匀），所得黑色液体放置在磁力搅拌器上，室温条件下以 的转速搅拌。后，所得混合液体以 的转速离心 ，弃掉上清液，得到黑色沉淀。为除去复合材料中残留的氯化血红素，所得黑色沉淀中加入 异丙醇，混匀，所得液体以 离心。重复上述洗涤过程 次后，所得沉淀重新分散于 的异丙醇中并存于 冰箱备用。同时将部分合成材料冷冻干燥，用于后续
10、的材料表征。基于 复合材料的比色法对 的检测取 合成材料（）与 缓冲液（，），（）混合，室温反应 。结束反应后，体系中加入 的不同浓度的谷胱甘肽混匀（），反应 。反应结束后，加入超纯水使溶液最终体积为 。混合均匀，对溶液的显色变化进行观察并取 溶液加入狭缝宽度为 的石英比色皿中，用紫外可见分光光度计进行检测。实际样品的检测为了探究该方法在生物环境中的传感性能，将样品血清稀释，并进行加标检测，加标量分别为 、和 。每个样品检测 三 次。计算得出 的回收率及实验的标准偏差。结果与分析 材料表征 复合材料表面形貌特征图 为石墨烯与氯化血红素制备 纳米复合材料的流程。氯化血红素是结构较简单的金属卟啉化
11、合物，可通过 相互作用和非共价作用与石墨烯复合，即氯化血红素中含有的吡咯环与石墨烯发生 相互作用吸附于石墨烯表面，在石墨烯两侧形成稳定的单分子膜，复合材料具有更高类酶催化活性。图 分别为，对应的 图。如图 所示，石墨烯是单层片状结构，其表面不平整，存在起伏。这些起伏在石墨烯表面形成三维基于石墨烯 氯化血红素复合物纳米酶可视化检测谷胱甘肽 范存霞等 褶皱，使石墨烯能稳定存在。如图、所示，石墨烯表面负载有分散均匀的纳米颗粒，其结果表明氯化血红素成功均匀地负载到石墨烯表面，粒径大小约为（）。图 （）材料的制备流程；（）石墨烯和（、）石墨烯 氯化血红素的 图（插图：石墨烯 氯化血红素 粒径分布）（电子
12、版为彩图）（）；（）（，）（：）材料组成和化学状态分析随后，对石墨烯和 复合材料进行了 表征。图 为石墨烯和 的 扫描全谱，可以看出，与石墨烯相比，复合材料中出现了明显的 峰和微弱的 峰。图 中各元素比例分布结果表明，纯石墨烯中 元素占比，氧元素占比，氮元素占比 ；而 复合材料中碳元素占比，氧元素占比，氮元素占比，铁元素占比，复合材料中的碳含量减少，而、三种元素含量均有所提高。如图 中 高分辨能谱所示，与石墨烯相比，复合材料中除含有（）基团和（）基团外，额外增加了 （）含氧基团，这是由于氯化血红素中存在 结构。在 高分辨能谱中（见图），、及 处的三峰分别对应、基团，基团的存在证实了石墨烯与氯化
13、血红素之间吸附氧后形成连接。由于石墨烯是一种由碳原子以 杂化轨道组成六角型呈蜂巢晶格的二维碳材料，未能 检测出石墨烯中和明显的光电子峰。图和图 石墨烯、石墨烯 氯化血红素的光电子能谱：（）全谱；（）元素组成；（）；（）；（）；（）（电子版为彩图）：（）；（）；（）；（）；（）；（）材料导报，（）：图 分别对应 的 和 谱。如图 所示，复合材料中含有 （）、（）及吡咯型（）基团。图 是 中 的高分辨能谱，处的光电子峰（）伴随着 处的卫星峰（）以及 处的光电子峰（），均对应氯化血红素的特征峰，其中卫星 峰的存在表明在氯化血红素中存在 配位。上述实验结果证实 复合材料的成功制备。为进一步验证复合材料
14、的成功制备，对氯化血红素及 进行 表征，如图 所示。氯化血红素分子 和 各存在一个特征吸收峰，分别由半吡啶环的对称伸缩震动和卟啉环的非对称 震动引起的。复合材料在 、处出现两个吸收峰，前者是由芳香环（带）中 碳的呼吸振动引起的，后者为芳香环（带）中 碳的同向伸缩振动的 模式的一阶散射吸收峰。由 变成 ，表明复合材料具有更多的活性位点。随后，采用傅里叶红外光谱对氯化血红素和 的官能团进行了检测。如图 所示，和 左右的峰对应于氯化血红素中基团中 的伸缩震动峰。处对应于氯化血红素中中 的伸缩震动峰。处的峰是由 的伸缩震动引起的。复合材料中 处的峰一般对应于 杂化碳中 的内震动峰。处的峰则对应于氯化血
15、红素中 的伸缩震动峰，红外结果表明复合材料中没有引入水分子。拉曼和红外光谱的结果进一步证实了 复合材料的成功制备。图 氯化血红素、石墨烯 氯化血红素的（）拉曼光谱和（）傅里叶红外光谱（电子版为彩图）（）（）复合材料催化性能石墨烯作为一种单原子层厚的二维材料，具有很大的比表面积，表面极易吸附一些小的气体分子，尤其是空气中的气体分子易吸附在石墨烯的表面，对石墨烯有显著的掺杂作用。纳米复合材料保留了石墨烯比表面积大的特性，因而可以吸附空气中的分子氧形成吸附态的自由基，在酸性条件下可直接将无色的 氧化成蓝绿色的，从而在 处出现清晰的紫外吸收峰。因为 复合材料分散在异丙醇中呈现灰色，所以发生反应前溶液是
16、浅灰色的。选取 为显色剂来验证复合材料的纳米酶催化活性，同时以合成 复合材料的两种原料作为对照，结果如图 所示，在未添加催化材料的情况下，在 处溶液的紫外吸光度几乎为零，且溶液未发生颜色变化，加入石墨烯作为催化剂的体系中，溶液颜色也未发生明显变化。氯化血红素存在 结构，其催化性能要优于纯石墨烯，溶液颜色变为浅绿色且紫外吸光有明显增强，可见氯化血红素自身具有一定的催化活性。相比于纯氯化血红素，复合材料的催化性能明显提高，且发生了明显的颜色变化，该结果结合表征结果，进一步表明 复合材料具有高效的纳米酶活性。在 比色体系中过氧化氢（）是不可缺少的物质，其浓度会影响显色结果。为了研究 对复合材料催化性能的产生影响，加入不同体积的，并设立空白对照组，研究体系的催化作用，其结果如图 所示。有无 存在的情况下，该催化剂都能将 氧化成，且其在 处的吸光度值变化可以忽略，因而最终确定 的存在不影响材料的催化性能。图 （）不同材料存在下体系的紫外吸收光谱（）；（）浓度对体系催化性能的影响（电子版为彩图）（）；（）接着为了研究 催化氧化的动力学，控制 催化剂的浓度不变，分别在不同浓度（、）中测量 谱，如图
