1、科 学实 验狂犬病病毒 GX074 株 P 蛋白 48 78 位区域氨基酸联合 M 蛋白突变株的构建及特性研究周桂全1，陈俊蓉1，韦显凯2，李晓宁1*，罗廷荣1*(1 广西大学动物科学技术学院，广西南宁 530005;2 广西壮族自治区动物疫病预防控制中心，广西南宁 530001)中图分类号:S834 5文献标识码:B文章编号:1002 5235(2023)01 0003 05doi:10 3969/j issn 1002 5235 2023 01 001摘要:为探究广西狂犬病病毒街毒 GX074 株 P 蛋白联合 M 蛋白对生物学特性的影响，实验以构建的弱毒疫苗株 rC HL 感染性 cDN
2、A 克隆质粒 pC HL 为基础，将 GX074 株 P 蛋白的 48 78 位区域氨基酸及 M蛋白联合替换到 pC HL 相同位置，进行突变病毒的拯救，经间接免疫荧光实验及序列测定获得突变体rC HL(GX074P48 78M)。结果表明，突变体病毒 rC HL(GX074P48 78M)基因组稳定，拯救后的荧光灶小于亲本弱毒 rC HL 株，大于亲本强毒 GX074 株及CVS 11 株;在细胞中的复制能力表现出与 rC HL株相似的特点，多步生长曲线显示突变体病毒滴度略低于 rC HL，而稍高于 GX074 株及 CVS 11 株。说明突变体毒株 rC HL(GX074P48 78M)相
3、较于亲本弱毒 rC HL 株复制能力有所降低，比亲本强毒 GX074株复制能力略高。关键词:狂犬病病毒;P 蛋白;病毒拯救;突变病毒;生长特性狂犬病是一种人畜共患病，是世界范围内一个重要的公共卫生问题，狂犬病主要通过患病动物抓咬传播，潜伏期受年龄大小、创口部位、毒力大小等因素影响，发病后死亡率达 100%，WHO 报道全世界每年造成约 7 万人死亡，现今仍无有效治疗手段，风险人群应主动接种疫苗进行预防，暴露后必须立即接种疫苗和免疫球蛋白1。狂犬病的病原体是狂犬病病毒(abies Virus，ABV)，它是弹状病毒科中的一种负链 NA 病毒，嗜神经性是狂犬病发病机制的主要特征。ABV 基因组编码
4、 5 种结构蛋白:核蛋白(N)、磷收稿日期:2022 04 18基金项目:广西自然科学基金项目(2020GXNSFAA297212)。作者简介:周桂全(1996 )，女，硕士研究生，研究方向:动物传染病防治与免疫学，1043484490 qq com。*通讯作者。E-mail:lizzylizzy2007 qq com;tingrongluo gxuedu cn。蛋白(P)、基质蛋白(M)、外表面糖蛋白(G)和NA 依赖的 NA 聚合酶(L)。糖蛋白 G 分布于病毒囊膜表面，M 蛋白位于膜下。N 蛋白结合在基因组 NA 上，后与 P 蛋白和 L 蛋白结合形成核糖核蛋白即 NP 结构，是病毒的基
5、本复制单位2。ABV P 蛋白是一种多功能蛋白，它是病毒NA 依赖的 NA 聚合酶的基本辅助因子，对基因组转录及复制非常重要。此外，它已被鉴定为干扰素拮抗剂，P 蛋白表达减少可降低 IFN 诱导的预防能力3。ABV M 蛋白在病毒组装和出芽中起重要作用，M 蛋白负责将 NP 招募到细胞膜上，一起凝结成紧密的螺旋结构出芽。M 蛋白也被证明在病毒转录和复制的平衡中发挥调节作用，M 蛋白表达提高时抑制病毒转录并刺激病毒复制4。通过反向遗传操作系统构建 NA 病毒的感染性 cD-NA 克隆，在 DNA 水平上对 NA 病毒进行基因改造的技术 是 生 物 学 领 域 的 一 大 突 破，1994 年Sc
6、hnell 等5 成功构建狂犬病病毒反向遗传系统并拯救出了 SAD B19 株;2001 年 Ito 等6 拯救出了狂犬病弱毒株 C HL 株，并构建了 N、P、L 基因的辅助质粒;2003 年 Inoue 等7 拯救出了适用于多种细胞系的 HEP Flury 株。这些反向遗传系统的建立为研究 ABV 的传播特性、基因功能、致病机理及研发疫苗等提供了有力工具。将弱毒株 rC HL 与实验室分离到的广西街毒 GX074 株的 P 和 M 蛋白进行氨基酸比对发现存在较大差异，为探究 GX074 P 蛋白的不同基因区域功能，基于 P 蛋白第 48 78 区域氨基酸的变异频率较大，选取 GX074 株
7、 P 蛋白第 48 78 区域氨基酸联合 GX074 株 M 蛋白替换入 rC HL 相同位置，拯救出突变病毒 rC HL(GX074P48 78M)，为后续探究广西街毒 GX074 株跟弱毒株 rC HL之间的差异分析提供有力工具。3广西畜牧兽医2023 年 Vol 39(1)1材料与方法1 1病毒株和细胞狂犬病病毒 GX074 株由广西大学动物科技学院预防兽医学实验室分离保存。BS T7/9 细胞由本实验室传代培养。1 2质粒rC HL 毒株的感染性 cDNA 克隆质粒 pC HL 及辅助质粒 pIES N、pIES P 和 pIES L 由日本岐阜大学 Minamoto N(源宣之)教授
8、惠赠;辅助质粒 pBluescript KS(+)、rC HL(GX074PM)感染性 cDNA 克隆质粒 pC HL(GX074PM)、rC HL(GX074M)感染性 cDNA 克隆质粒 pC HL(GX074M)由本实验室构建并保存。1 3主要试剂与材料限制性内切酶 Age购自 NEB 公司;限制性内切酶 Sac、PrimeSTA MAX Premix(2 )、2 Taq PC MasterMix、T4 DNA 连接酶、M ML V反转录酶、pEASY T1 载体购自 TaKaa 公司;胶回收试剂盒(Gel Extraction Mini Kit)购自康为世纪生物科技有限公司;无内毒素质
9、粒抽提试剂盒购自omega 公司;Transi 1 感受态细胞、TOP10 感受态细胞购自北京全式金生物科技有限公司;Trizol 组织裂解液购自 genstar 公司;DMEM 干粉培养基、无血清培养基 Opti MEM 购自 Gibco 公司;胎牛血清(FBS)购自南京诺唯赞生物科技有限公司;转染试剂 Lipofectamine TM 2 000 购自 Invitrogen 公司;狂犬病病毒 N 蛋白单克隆抗体购自浙江同点公司;免疫荧光染色试剂盒 抗小鼠 Alexa Flour488购自碧云天生物有限公司;引物合成及测序由北京六合华大基因公司完成。1 4引物设计与合成根据 GenBank
10、已提供的 rC HL 基因组序列(序列号 AB 009 663)和 GX074 株基因组部分序列，设计替换 GX074 株 P、M 基因的 cDNA 克隆所用引物(表 1)。1 5狂犬病突变病毒 rC HL(GX074P48 78M)感染性 cDNA 克隆的构建将 GX074 的 P 基因与 rC HL P 基因进行氨基酸序列比对，筛选 GX074 P 基因第 48 78 位氨基酸设为 P48 78片段，将 GX074 株 P 基因 48 78位氨基酸片段与 GX074 株 M 基因氨基酸全长片段联合替换到 rC HL 毒株相同位置(图 1)。表 1狂犬病突变病毒基因片段扩增引物引物名称引物序
11、列扩增片段长度(bp)退火温度()N PFCAGGACAAAACACCGGTA-ACTATAAAACN PCTCATATCGTCAGGGAGATT-GTCCACTTCTATAGGTTCTC1 14563 577 3P48 78FGAGAACCTATAGAAGTGGA-CAATCTCCCTGACGATATGAGP48 78TTCATCCATCTGAAAGTCCTC-CCGATATTTGCTTTCTCCT13477 383 7P MFAGGAGAAAGCAAATATCGG-GAGGACTTTCAGATGGATGAAP MCCGCGGGATATAGTCTGAC-TATTCT1 39483 762 6
12、以 pC HL(GX074PM)质粒为模板扩增出GX074 P 基 因 P48 78片 段;以 质 粒 pC HL(GX074M)为模板扩增自 Age酶切位点至 P 基因突变位点前的 N P 段、P 基因突变位点后至Sac酶切位点的 P M 片段。通过重叠 PC 方法，先将 N P 段和 P48 78段重叠为 N P48 78段，后将 N P48 78与 P M 段重叠为段。突变片段与pEASY T1 载体连接成 pEASY T1(N P48 78M)做 TA 克隆，通过测序确定突变片段序列，正确后用筛选出的限制性内切酶 Age、Sac 分别双酶切 pEASY T1(N P48 78 M)和
13、pC HL，对酶切后的 N P48 78 M 片段和 pC HL 质粒大片段进行胶回收，用 T4 DNA 连接酶连接，将连接产物转化 TOP10 感受态细胞，挑选单个菌落，菌液PC 鉴定后取阳性菌液抽提质粒，酶切初步鉴定后送测序。图1狂犬病突变体病毒cDNA 克隆构建示意图及毒株氨基酸序列比对A 狂犬病突变病毒 cDNA 克隆构建示意图;B rC HL 株与GX074 株 P 蛋白氨基酸序列比对图4广西畜牧兽医2023 年 Vol 39(1)1 6狂犬病突变病毒 rC HL(GX074P48 78M)的拯救转染前 20 24 小时，将 BST7 9 细胞传到12 孔板上，当细胞密度达到 70%
14、以上时进行转染。将感染性全长 cDNA 克隆质粒 2 g，辅助质粒pIES N、pIES P、pIES L 分别取 0 4、0 1、0 2 g 加到含 200 L 无血清培养基 OPTI MEM的 EP 管中，轻缓混匀;取 4 L 脂质体 Lipofectami-neTM 2 000 溶于含 200 L OPTI MEM 的 EP 中，混匀室温静置5 min;将质粒与脂质体混合，室温静置 20 min。取出 12 孔板，弃去旧培养基，用 DMEM 洗涤两次细胞，每孔加入 400 L 与脂质体混合的质粒，置于 37 5%CO2培养箱培养，6h 后弃去混合液，每孔加入 1 mL 含 2%FBS 的
15、 DMEM 培养 6d，中途3d 时每孔加入 1 mL 2%FBS 的 DMEM。6d 后将12 孔板置于 80超低温冰箱冻融 2 次后收集细胞及上清于 2 mL EP 管中，4 12 000 rpm 离心 5min 后保存于 80冰箱。1 7IFA 鉴定拯救的突变体病毒将 BST7 9 细胞接种到 96 孔板，24 h 后弃去旧培养液，以每孔 100 L 接入转染样品，阳性对照接种 rC HL 病毒，阴性对照接种 DMEM，培养2h 后弃去样品，更换含甲基纤维素的2 DMEM 培养液继续培养，72 h 后进行间接免疫荧光实验。弃去 96 孔板中的样品，用 PBS 洗涤两次，吸干孔中液体后加入
16、固定液(甲醇 丙酮=1 1)，于冰上固定20 min;弃去固定液，用 PBS 洗涤2 次，拍干孔中残留的洗液，每孔加入 30 L 2 000 倍稀释的抗狂犬病病毒 N 蛋白单抗，置于 37 培养箱孵育 1h;取出 96 孔板，弃去一抗，用 PBS 洗涤 3 次，每孔加入 30 L 1 000 倍稀释的抗小鼠 Alexa Flour488荧光二抗，37培养箱孵育 1 h;取出96 孔板，弃去二抗，用 PBS 洗涤 3 次，荧光倒置显微镜观察。1 8多步生长曲线的测定将 BST7 9 细胞接种到 24 孔板，各个病毒分别以 0 01 MOI(multiplicity of infection，MOI)感染 BST7 9 细胞，于 37 5%CO2培养箱培养2 h后弃去病毒液，加入 500 L 含 2%FBS 的DMEM，37 5%CO2培养箱培养。分别于接种后12 h、24 h、48 h、72 h 和 96 h 收集细胞上清进行IFA 实验测定病毒滴度，取不同时间点的病毒滴度绘制病毒生长动力学曲线。2结果与分析2 1狂犬病突变病毒 rC HL(GX074P48 78M)感染性 cDNA 克
