1、广西医科大学学报JOURNAL OF GUANGXI MEDICAL UNIVERSITY2022 Dec；39（12）抗NMDAR脑炎小鼠血脑屏障破坏的实验性研究*劳大媛，龚卓伟，李泰燕，黄文（广西医科大学第一附属医院神经内科，南宁530021）摘要目的：探讨抗N-甲基-D-天冬氨酸受体（NMDAR）NR1亚基氨基末端结构域主动免疫诱导NMDAR脑炎对小鼠紧密连接（TJ）跨膜蛋白Occludin、带状闭合蛋白1（ZO-1）和血脑屏障（BBB）完整性的破坏作用。方法：将C57BL/6小鼠随机分为对照组和模型组，每组10只。模型组用NMDAR NR1受体区域的N356/G385氨基酸肽段主动免疫
2、C57BL/6小鼠，建立抗NM-DAR脑炎小鼠模型,对照组注射不含肽段的等体积乳剂混合物，主动免疫6周。采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测小鼠血清抗NMDAR IgG抗体，水迷宫和旷场实验评估小鼠记忆和焦虑行为，荧光素钠法测定BBB通透性，实时荧光定量PCR（RT-qPCR）法检测大脑皮质NMDAR NR1、Occludin、ZO-1mRNA表达，western blotting法检测大脑皮质NMDAR NR1、基质金属蛋白酶9（MMP9）、Occludin、ZO-1和神经元特异性核蛋白（NeuN）蛋白表达。结果：与对照组比较，模型组小鼠血清中抗NM-DAR IgG抗体为阳性，并出现明显的
3、记忆障碍和焦虑行为（均P0.05）。模型组小鼠脑荧光素钠渗漏量明显增加（P0.001），大脑皮质NMDAR NR1、Occludin和ZO-1 mRNA及蛋白表达量降低，MMP9蛋白表达量升高，NeuN蛋白表达量降低（均P0.05）。结论：利用NMDAR NR1356-385肽段主动免疫成功建立了抗NMDAR脑炎小鼠模型，产生抗NMDAR抗体，表达增加的MMP9可能破坏TJ蛋白从而使BBB功能障碍，导致大脑神经元损伤，并出现精神行为学改变。关键词抗N-甲基-D-天冬氨酸受体脑炎；紧密连接；血脑屏障；基质金属蛋白酶9中图分类号：R742.9文献标志码：A文章编号：1005-930X（2022）1
4、2-1924-07DOI：10.16190/ki.45-1211/r.2022.12.009Study on the destruction of blood-brain barrier in mice with anti-NMDAR encephalitisLao Dayuan,Gong Zhuowei,Li Taiyan,Huang Wen.(Department of Neurology,The First Affiliated Hospital ofGuangxi Medical University,Nanning 530021,China)AbstractObjective:To
5、investigate the destruction of tight junction(TJ)transmembrane protein(Occludin),Zo-na occludens-1(ZO-1)and blood-brain barrier(BBB)integrity in mice with Anti-N-methyl-D-aspartate receptor(NMDAR)encephalitis immunized actively with the amino-terminal domain of NMDAR NR1 subunit.Metho-ds:C57BL/6 mic
6、e were randomly divided into control group and model group,with 10 mice in each group.Inthe model group,C57BL/6 mice were actively immunized with N356/G385 amino-terminal domain peptide fromNMDAR NR1 receptor region to establish a mouse model of anti-NMDAR encephalitis,while mice in the con-trol gro
7、up were injected with an equal volume of emulsion mixture without peptide and actively immunized for 6weeks.Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)was used to detect anti-NMDAR IgG antibody in mice se-rum.Morris water maze and open field test were used to evaluate the memory and anxiety behavior of
8、 the mice.Fluorescein sodium method was used to determine BBB permeability.Real-time fluorescence quantitative poly-merase chain reaction(RT-qPCR)was used to analyze the mRNA expressions ofNMDAR NR1,OccludinandZO-1in cerebral cortex.Western blotting was used to detecte the protein expressions of NMD
9、AR NR1,matrixmetalloproteinase 9(MMP9),Occludin,ZO-1 and neuron-specific nucleoprotein(NeuN)in cerebral cortex.Re-sults:Compared with the control group,the serum anti-NMDAR IgG antibody in the model group was positive,and there were obvious memory impairment and anxiety behavior(allP0.05).In model g
10、roup,the brain sodi-um fluorescein leakage significantly increased(P0.001),the mRNA and protein expressions of NMDAR NR1,Occludin and ZO-1 in the cerebral cortex decreased,MMP9 protein expression increased,and NeuN pro-tein expression decreased(allP0.05).Conclusion:*基金项目：国家自然科学基金资助项目（No.82060236）；广西
11、自然科学基金资助项目（No.2019GXNSFDA245032）通信作者，E-mail：收稿日期：2022-10-16 1924The mouse model of anti-NMDAR encephalitis is established successfully by active immunization with the pep-tide of NMDAR NR1356-385and anti-NMDAR antibody is generated.The increased expression of MMP9 may de-stroyTJ protein,leadingto BB
12、B dysfunction,which will cause brain neuron damageand psychobehavioralchanges.Keywordsanti-N-methyl-D-aspartate receptor encephalitis;tight junction;blood-brain barrier;matrix metallo-proteinase 9自身免疫性脑炎（AE）患病比例占脑炎病例的10%20%，其中最常见的是抗N-甲基-D-天冬氨酸受体（NMDAR）脑炎，约占 AE 患者的 80%1。抗NMDAR 脑炎与针对 NMDAR NR1 亚基的免疫球蛋
13、白G（IgG）抗体相关，典型的临床表现为精神症状、认知功能下降、癫痫发作、意识障碍、中枢性低通气等，约80%的患者通过免疫疗法和肿瘤切除后病情得到改善，但是恢复缓慢2。NMDAR是一种离子型谷氨酸受体，是由其亚单位NR1、NR2和NR3装配而成的异四聚体阳离子通道，参与神经系统的多种重要生理功能，其异常又可引起中枢神经系统的功能紊乱3-4。血脑屏障（BBB）由脑微血管内皮细胞及细胞间紧密连接（TJ）、周细胞、星形胶质细胞末端足突和基底膜组成，在保护中枢神经系统免受血液传播物质的侵害方面发挥着关键作用5。BBB完整性的丧失会导致血管通透性增加，使有毒的细胞、微生物和血液衍生分子进入大脑，诱发炎症
14、和免疫反应，导致神经退行性疾病（如阿尔茨海默病、帕金森病、肌萎缩侧索硬化症和多发性硬化症）及急性中枢神经系统疾病（如脑卒中、创伤性脑损伤、脊髓损伤和癫痫）的发生6-8。内皮TJ通过细胞旁途径调节水、离子和分子的运输，是血管内的重要屏障，维持血管内环境的稳定。因此，探讨BBB通透性调节的分子机制对此类疾病的治疗具有重要意义。BBB的TJ蛋白包括跨膜蛋白，如claudin家族成员、Oc-cludin、tricellin和jams，以及细胞质蛋白，如带状闭合蛋白（ZO）和cinglin。其中Occludin是一种跨膜蛋白，在脑内皮细胞中高表达，通过ZO-1、ZO-2和ZO-3蛋白相连与细胞骨架相衔接
15、，在细胞旁通透性中起关键作用5,9。基质金属蛋白酶（MMPs）是一类调节多种生理过程的酶，包括生长因子的激活、酶原的分解和细胞外基质的重塑，在BBB的形成中起着关键作用。研究表明，MMP9的增加可以破坏细胞外基质和TJ蛋白，导致BBB功能障碍10。动物研究证实，对NMDAR的特定免疫反应诱发了大量类似抗 NMDAR 脑炎的症状。然而，抗NMDAR脑炎确切的发病机制，尤其是BBB破坏是否为其始动因素，目前尚不清楚。本研究通过主动免疫构建抗NMDAR脑炎小鼠模型，比较NMDARNR1、MMP9、Occludin、ZO-1、神经元特异性核蛋白（NeuN）等相关分子的表达，观察抗NMDAR脑炎对小鼠B
16、BB破坏的作用。1材料与方法1.1主要试剂完全弗氏佐剂（CFA）（Chondrex，美国）；百日咳毒素（PTX）（Sigma公司，美国）；NM-DAR NR1356-385多肽（吉尔生化有限公司，中国）；酶联免疫吸附试验（ELISA）检测试剂盒（江莱生物，中国）；荧光素钠、三氯乙酸（TCA）（阿拉丁有限公司，中国）；兔抗NMDAR NR1多克隆抗体（Abcam，美国）；兔抗Occludin多克隆抗体、兔抗ZO-1多克隆抗体、兔抗MMP9多克隆抗体、兔抗NeuN多克隆抗体、兔抗 GAPDH 多克隆抗体（Proteintech，中国）；NucleoZol试剂盒（MN公司，德国）；反转录、实时荧光定量PCR（RT-qPCR）试剂盒（Takara公司，日本）。1.2实验动物及分组20 只 8 周龄 SPF 级雌性C57BL/6小鼠，体重1822 g，由广西医科大学实验动物中心提供。将小鼠随机分为对照组和模型组，每组10只。本实验操作严格按照实验动物伦理学相关规范进行。1.3NMDAR NR1 亚基诱导模型11用 NMDARNR1356-385进行胞外肽段免疫，将肽段乳化在等体积的CFA和PBS
