1、农业环境科学学报Journal of AgroEnvironment Science2022，41（12）:2763-27712022年12月卢映菲，马丽雅，张召贤，等.具毒死蜱降解功能的水稻内生菌降解特性及应用J.农业环境科学学报,2022,41（12）：2763-2771.LU Y F,MA L Y,ZHANG Z X,et al.Characteristics and application of chlorpyrifos-degrading endophytic bacteria from rice（Oryza sativaL.）J.Journal of Agro-Environmen
2、t Science,2022,41（12）：2763-2771.开放科学OSID具毒死蜱降解功能的水稻内生菌降解特性及应用卢映菲1，马丽雅2*，张召贤1，孙星2，葛静2，吴祥为1*，余向阳1，2（1.安徽农业大学资源与环境学院，合肥 230036；2.江苏省农业科学院农产品质量安全与营养研究所，南京 210014）Characteristics and application of chlorpyrifos-degrading endophytic bacteria from rice（Oryza sativa L.）LU Yingfei1,MA Liya2*,ZHANG Zhaoxian1,
3、SUN Xing2,GE Jing2,WU Xiangwei1*,YU Xiangyang1,2（1.College of Resources and Environment,Anhui Agricultural University,Hefei 230036,China;2.Institute of Food Safety and Nutrition,Jiangsu Academy of Agricultural Sciences,Nanjing 210014,China）Abstract：To tap the resources of chlorpyrifos-degrading endo
4、phytic bacteria and apply these bacteria in bioremediation to improveagricultural production,a chlorpyrifos-degrading endophyte strain was isolated from the roots of rice（Oryza sativa L.）using amicrobiological culture method in a contaminated factory.The characteristics and effect of the strain on c
5、hlorpyrifos degradation in ricecrops were investigated.Based on the morphological characteristics of the endophyte and 16S rRNA sequence analysis,the strain wasidentified as Bacillus sp.and named as CP40.Bacillus sp.CP40 contained opd,which encodes an organophosphorus hydrolase.Thedegradation rate o
6、f chlorpyrifos was 58.4%when the gene was heterologously expressed.Optimization analysis of the degradationconditions indicated that the lowest chlorpyrifos residues were observed at an initial chlorpyrifos concentration of 10 mgL-1,temperature of30,and pH of 7.Strain CP40 colonized and promoted the
7、 growth and development of rice plants and removed 30.9%of chlorpyrifos fromthese plants.Our results suggest that endophytic bacteria can reduce chlorpyrifos residues in rice.Keywords：chlorpyrifos;endophyte;degrading characteristic;colonization;rice收稿日期：2022-11-22录用日期：2022-12-02作者简介：卢映菲（1998），女，广东潮州
8、人，硕士研究生，从事环境微生物研究。E-mail：*通信作者：吴祥为E-mail：；马丽雅E-mail：基金项目：国家自然科学基金项目（32272600）；江苏省农业科技自主创新资金项目（CX（22）3074）；国家重点研发计划项目（2021YFD1700803）Project supported：The National Natural Science Foundation of China（32272600）；The Jiangsu Agricultural Science and Technology Innovation Fund（CX（22）3074）；The National Ke
9、y Research and Development Program of China（2021YFD1700803）摘要：为挖掘毒死蜱降解内生菌资源、强化功能内生菌在农业生产中的应用，通过微生物梯度驯化技术，从农药池周边生长的水稻根组织中分离纯化获得一株能以毒死蜱为唯一碳源的降解内生菌CP40，研究了该菌株的毒死蜱降解特性及对作物中残留毒死蜱降解的影响。基于16S rRNA和细菌形态学特征，将菌株CP40鉴定为芽孢杆菌（Bacillus sp.CP40）。菌株CP40含有机磷降解酶基因opd，异源表达该基因后毒死蜱的降解率达58.4%。降解条件优化实验表明，毒死蜱初始浓度为10 mgL-1、
10、温度为30、pH为7时，菌株CP40对毒死蜱的降解效果最佳。此外，发现菌株CP40具有促生能力，接种菌株CP40可显著促进水稻生长，并能将水稻体内毒死蜱含量降低30.9%。研究表明，功能内生菌在调控水稻体内毒死蜱的降解过程中可发挥重要作用。关键词：毒死蜱；内生菌；降解特性；定殖；水稻中图分类号：X172；X592文献标志码：A文章编号：1672-2043（2022）12-2763-09doi:10.11654/jaes.2022-1193农业环境科学学报第41卷第12期毒死蜱（Chlorpyrifos，CP）是一类高效广谱的有机磷杀虫剂，主要用于防治水稻、果树、小麦等植物上稻飞虱、蚜虫等害虫1
11、。随着毒死蜱的大量及不合理使用，作物中毒死蜱的残留问题引发广泛关注。研究表明，在施用过程中仅有少量毒死蜱（0.1%）作用于靶标生物，而大多数毒死蜱会经弥散、淋溶等途径进入生态环境2-3，且未作用于靶标生物的毒死蜱不仅在土壤中大量沉积4，在番茄、花生、谷物等作物中也有大量残留5-6，在蔬菜中残留检出率甚至高达100%7。农产品中残留的毒死蜱可通过食物链进入人体，导致人体健康风险增加2。大量研究表明，人体持续摄入微量毒死蜱可导致精子活力下降、肝肾功能受损、胎儿发育障碍和免疫系统异常等问题4，8。因此，如何促进生态环境和农作物中毒死蜱的降解，从而降低人体对残留农药的摄入风险是目前亟需解决的问题。微生
12、物修复具有效率高、成本低、环境友好等特点，已成为环境中残留农药修复的主要途径之一。目前已鉴定出多株具毒死蜱降解功能的微生物，包括假单胞菌属（Pseudomonas sp.）9、肠杆菌属（Enterobactersp.）10和鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas sp.）11等。DENG 等12从工业污染区筛选得到的一株寡养单胞菌 G1，在温度为 40 时，振荡培养 24 h能降解 63%的毒死蜱（50 mgL-1）；另一株从水稻田分离得到的鞘氨醇杆菌JAS3，可在5 d内将300 mgL-1的毒死蜱完全降解13。研究表明从环境中分离得到的功能菌株对残留农药降解效果好，但易受环境因素影响，持
13、效期短，且难以降解植物或农作物中的残留农药14。植物内生菌具有稳定定殖在植物体内的能力，在宿主植物中具有稳定的生存空间，与植物互利共生可降低环境因素对菌株降解功能的影响。另外，内生菌可通过自身分泌植物激素吲哚-3-乙酸（IAA）或氨基环丙烷羧酸（ACC）脱氨酶等促进植物生长发育，增强植物对环境胁迫的抵御能力，协同植物促进有机污染物降解15-17。KHAN 等18将植物内生菌 Pseudomonasputida PD1分别接种于柳树和草，发现该菌可有效缓解菲对植物的毒害作用，且对土壤中菲的去除率为25%40%。然而，目前对微生物修复农药污染的报道主要集中于根际细菌或土壤微生物降解特性的研究，而关
14、于内生菌的降解特性以及内生菌-植物体系强化农药降解作用机制的研究较少。本研究从农药池周边生长的水稻根内筛选到一株具毒死蜱降解能力的内生菌CP40，系统评估了该菌株的毒死蜱降解特性，并采用水培系统探究了CP40定殖对水稻降解残留毒死蜱的影响，以期为功能内生菌-植物系统代谢毒死蜱，降低残留农药对农产品的污染风险提供理论依据。1材料与方法1.1 材料与试剂1.1.1 实验材料水稻种子南粳5055受赠于江苏省农业科学院粮食作物研究所。1.1.2 主要试剂化学试剂：毒死蜱原药（97%）购于南京红太阳股份有限公司；毒死蜱标准品（99.9%）购于德国Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；正己烷（色谱
15、纯）及乙腈（色谱纯）购于德国Merk公司；2Yeast PCR mix购于瑞源生物技术有限公司。无机盐（MSM）培养基：MgSO47H2O0.4 g，FeSO47H2O 0.2 g，K2HPO40.2 g，（NH4）2SO40.2g，CaSO40.08 g，去离子水 1 L，pH 7.0；LB 液体培养基：胰蛋白胨10 g，酵母膏5 g，NaCl 10 g，去离子水1L，pH 7.0；改良阿须贝氏（无氮）琼脂培养基购于上海瑞楚生物科技有限公司，无机磷细菌培养基购于海博生物公司，两种培养基均按配方配制；以上培养基于121 灭菌20 min后备用。1.2 毒死蜱降解内生菌的筛选及鉴定1.2.1 菌
16、种分离及纯化将取农药池周边生长水稻的根组织清洗干净并吸干表面水分，对水稻根表面进行消毒后，将其置于灭菌后的研钵中，加入1 mL MSM培养基，缓慢研磨成汁液。吸取200 L研磨液于含20 mL LB培养基的离心管中，30、180 rmin-1振荡培养12 h，菌液离心后去上清，用PBS缓冲液将菌体清洗45次后，将菌体置于含毒死蜱的MSM培养基进行4次梯度驯化。每次以10%的接菌量加入50 mL的MSM培养基，并于30、180 rmin-1振荡培养5 d，毒死蜱的浓度分别为1、5、10、20 mgL-1。取50 L驯化后的菌液涂布于以毒死蜱（10 mgL-1）为唯一碳源的MSM固体培养基中，将生长的单菌落进行培养纯化。1.2.2 菌种筛选及鉴定将纯化后的菌株接种于以毒死蜱为唯一碳源的MSM液体培养基中，以添加等量无菌水作为对照组，振荡培养24 h后，测定培养基中毒死蜱的残留量并计算降解率。选取降解能力最强的菌株作为目标菌株，提取细菌 DNA，经 16S rRNA 通用引物进行 PCR 扩2764卢映菲，等：具毒死蜱降解功能的水稻内生菌降解特性及应用2022年12月增，将PCR产物送至南京
