1、张明辉，时曼丽 钼与氮形态对不同氮效率冬小麦氮吸收、代谢及根系发育的影响 J 江苏农业科学，2023，51(4):114 121doi:10 15889/j issn1002 1302 2023 04017钼与氮形态对不同氮效率冬小麦氮吸收钼与氮形态对不同氮效率冬小麦氮吸收、代谢及根系发育的影响代谢及根系发育的影响张明辉，时曼丽(南阳市农业科学院，河南南阳 473000)摘要:钼(Mo)是植物必需的微量元素，在氮代谢和同化过程中起着关键作用，然而关于 Mo 对不同氮形态的功能效果知之甚少。采用盆栽土培试验，基于周麦 28(高效率)、洛麦 34(低效率)2 个氮效率基因型，设置 2 个 Mo 水
2、平(0、50 mg/kg)、3 个氮源形态(NO3、NO3NH+4、NH+4)，探索钼与氮形态对不同氮效率冬小麦氮吸收、代谢及根系发育的影响。结果表明，Mo 在 3 种氮源形态供应下的小麦根系氮吸收、代谢中均具有促进作用。施 Mo 条件下，小麦根系氮组分(NO3 N、NO2 N、NH+4 N)含量、同化物(游离氨基酸、可溶性蛋白)含量、根系发育、氮转运基因(TaNRT1、TaNRT2)相对表达量及氮代谢酶(NR、NiR、GS、GOGAT)活性均表现为 NO3NH+4处理 NO3、NH+4处理，且上述指标均以周麦28 洛麦34。不施 Mo 条件下，相关氮代谢及根系发育指标仍以周麦28 优于洛麦3
3、4，且周麦28 相关氮素代谢及同化参数波动较小，这意味着氮高效基因型比氮低效基因型小麦品种更能适应缺钼条件。综上所述，在小麦生产中，发展种植氮高效基因型品种结合施 Mo 且以 NO3NH+4作为氮源更有利于小麦根系发育，根系氮素吸收、代谢及同化能力更强。关键词:小麦;钼 氮相互作用;氮效率基因型;氮代谢酶;基因表达中图分类号:S512 1+10 4文献标志码:A文章编号:1002 1302(2023)04 0114 07收稿日期:2022 09 12基金项目:河南省重大科技专项(编号:161100110400)。作者简介:张明辉(1966)，男，河南南阳人，副研究员，研究方向为农作物育种、栽培
4、技术及新品种示范推广。E mail:13938976429139 com。氮素是小麦生长发育过程中所需的最多的矿质元素之一，氮素对保证小麦产收、品质及成品风味具有至关重要的作用1。然而在小麦田间生产中，施氮量与产量间存在阈值，近年来，氮肥的过量施用已成为小麦可持续化生产的瓶颈问题，其在造成环境污染的同时伴随着小麦生产成本的增加2。小麦根系的氮素摄取、同化能力与地上部氮素同化、转运以及氨基酸、蛋白质的合成密切相关3。小麦对土壤氮的摄取能力一方面受土壤环境因素影响(例如土壤水分、氮浓度)，另一方面取决于植物自身的基因差异4。一般而言，耐低氮、氮高效品种可通过调控根系构型、根系分泌物组成等策略增加植
5、株对氮素的吸收量，且氮素代谢更旺盛、同化能力更强5。硝态氮(NO3 N)和铵态氮(NH+4 N)是小麦氮素根系吸收的主要氮素形态，然而不同植物对两者的吸收偏好及方式存在差异6。一般而言，在通气状况良好的土壤中，NO3 N 的浓度比 NH+4 N高出 10 1 000 倍，但在寒冷、淹渍及酸性条件下的环境中，由于硝化作用受限，NH+4 N 成为植物的主要氮源7。当硝铵同浓度共存时，NH+4 N 更容易进入根系，然而植物根系直接累积大量的 NH+4 N会导致生理毒性8。NO3 N 具有流动性强、无累积毒性及吸收耗能较低等优点使得其成为多数植物吸收的主要形态。在绿色植物中，由于 NO3 N为氧化态，
6、植物体中的含氮化合物呈还原态，进入植物细胞的 NO3 N 需先还原后方可被植物细胞同化9。这一过程中，NO3 N 首先在硝酸还原酶(NR)的作用下转化为亚硝态氮(NO2N)，NO2 N在亚硝酸还原酶(NiR)的作用下还原为 NH+4 N，接着 NH+4 N 通过谷氨酰胺合成酶(GS)催化为谷氨酰胺，最后谷氨酰胺经由谷氨酸合成酶(GOGAT)以循环 的 相 互 作 用 方 式 同 化 为 不 同 类 型 的 氨基酸10 11。钼(Mo)是高等植物生长发育的必需微量元素之一。在我国由于对钼的功能缺乏认识，缺 Mo 在411江苏农业科学2023 年第 51 卷第 4 期酸性土壤中较为普遍，据相关报道
7、大约4 450 万 hm2的耕地处于轻度缺钼状态12。大量研究表明，Mo在植株光合作用、氮代谢、激素信号传导和非生物胁迫中扮演重要作用，深刻影响着植物的生长发育和生理代谢过程13。此外，Mo 也是钼辅因子生物合成的必需金属元素，钼辅因子是相关酶促反应的重要元件，其可提高 NR、NiR、GS 等的活性，在氮素还原、同化及固定过程中发挥不可替代的作用14。以往的研究主要集中于植物对不同氮源的响应，但关于施 Mo 与不同氮源下对冬小麦氮代谢及同化的影响鲜有报道。基于此，本研究探索了 Mo 与氮形态对不同氮效率小麦叶片中氮代谢酶活性、氮转运基因表达及氮同化产物的影响，以期为小麦的钼肥施用提供理论依据。
8、1材料与方法1 1供试材料试验于 2021 年 11 月至 2022 年 2 月在南阳市农业科学院进行。供试小麦品种为周麦 28、洛麦34，品种筛选结果表明周麦 28、洛麦 34 分别为氮高效、氮低效基因型15，两者全生育期分别为 231、230 d，来自河南省农业科学院经济作物研究所。种子采用 0.5%次氯酸钠进行表面灭菌 15 min，然后用去离子水冲洗数次并浸泡 12 h，放置于铺垫润湿滤纸的培养皿中，于 28 培养箱中暗处理催芽24 h。供试钼为钼酸钠(Na2MoO4)，氮肥分别为硝态氮(NO3 N)和铵态氮(NH+4 N)，三者均为分析纯，均购自 Sigma 化学试剂公司。磷肥为磷酸
9、钙(P2O512%)，钾肥为氯化钾(K2O 60%)，均购自河南兴发昊利达肥业有限公司。供试土壤取自河南省南阳市农业科学附近原始土，土壤类型为偏酸性沙壤土。土壤经风干后混匀过 3 mm 网筛，土壤 pH 值为 6 54，土壤有机质含量为 11 62 g/kg、全氮含量为 0 89 g/kg、碱解氮含量为 44 58 mg/kg、有效磷含量为 13 52 mg/kg、速效 钾 含 量 为 62 96mg/kg、有 效 钼 含 量 为0 13 mg/kg。1 2试验设计试验采用完全随机设计，设置 2 个施 Mo 水平:施用(+Mo)或不施用(Mo)钼酸钠;3 个氮素水平处 理:单 施 硝 态 氮(
10、NO3)、硝 铵 组 合 施 用(NO3NH+4)、单施铵态氮(NH+4);2 个小麦品种:氮高效基因型(周麦 28)、氮低效基因型(洛麦 34)。共12 个处理组合，每个处理重复 4 次。其中 Mo、NO3、NH+4的 纯 用 量 分 别 为 50 mg/kg、2 g/kg、2 g/kg;铵硝组合施用则为 1 g/kg NO3 N+1 g/kgNH+4 N。盆栽装置为黑色方形塑料盒(长 宽 高，20 cm 15 cm 15 cm)，每盆装 2 5 kg 土。每盆施1 2 g 纯磷，磷、钾肥施用比例 m(P2O5)m(K2O)=12 8，相关氮磷钾肥皆采用水溶方式提前施入，并保持土壤 75%的
11、持水量平衡 1 周。每盆播入小麦种子 10 粒，出苗后减至 5 株。于拔节抽穗期(168 d)采用根施方式施入 Mo 溶液，1 周后盆栽收获。种植期间不定时加入无菌水，其他管理措施同小麦作物培育方法。1 3样品采集及测定分析13 1小麦根系氮组分及含氮同化物含量测定培养结束后收获小麦植株根系，保存于 20 备用。小麦根系硝酸盐(NO3 N)、亚硝酸盐(NO2N)和 铵 盐(NH+4 N)的 含 量 测 定 方 法:铵 盐(NH+4 N)含量使用 1 mol/L 氯化钾浸提 靛酚蓝比色法测 定16，硝 酸 盐(NO3 N)、亚 硝 酸 盐(NO2 N)含量采用离子色谱法测定17。小麦根系含氮同化
12、物包含游离氨基酸、可溶性蛋白，游离氨基酸含量参照 GB/T 309872020植物中游离氨基酸的测定 借助 Nano Drop 2000 UV VIS 紫外分光光度计(Thermo，Fisher，Waltham，MA，USA)采用茚三酮比色法测定。可溶性蛋白含量使用考马斯亮蓝 G 250 法，采用用分光光度计在595 nm 处测定18。1 3 2小麦根系构型测定用自来水轻轻冲洗根部以去除沙土，将植株根系漂浮在有机玻璃托盘约1 cm 深度的水中，并使用台式扫描仪(EPSONPerfection V800 Photo，Japan)进 行 扫 描，使 用WinRHIZO 图像分析系统测定根系总根长、
13、表面积、平均直径和根尖数。1 3 3小麦根系氮素转运蛋白基因表达水平测定采用 TRIzol 试剂盒(Invitrogen)对小麦根系进行总 RNA 提取，使用 DNaseI Verso cDNA 合成试剂盒将 RNA 反 转 构 建 cDNA。使 用 ReverTra AceqPCR RT Kit 从总 RNA 合成第一链 cDNA。实时PCR 采用 SYBR Green mix 与 7500 快速实时 PCR序列检测系统上进行。以小麦 TaActin 为对照基因，相关氮代谢同化酶基因及氮转运蛋白基因的引物511江苏农业科学2023 年第 51 卷第 4 期序列见表 1。热曲线反应程序如下:9
14、5 30 s、95 10 s、60 20 s、72 30 s，40 个循环。对熔化曲线进行分析，并进行琼脂糖凝胶电泳以保证扩增子质量。具体反应体系、反应程序步骤参照 Wang等的研究19，采用 2 CT断层扫描方法计算目标基因的相对转录丰度。表 1氮代谢同化酶基因及氮转运蛋白相关基因的 qRT PCR 引物序列信息基因名登录号正向引物序列(53)反向引物序列(53)产物长度(bp)TaActinAB181991ATACACGAAGCGACATACAATTCCACTGAGAACAACATTACC89TaNRT1HF544987GCCAGGGGCTACGTGTACGCAGCCTCAGTGACCGA
15、C125TaNRT2AF288688GCTGCTTGTGGTGCTGTATGAGCGACGGGTAATGTGC1171 4数据处理与统计分析采用 Microsoft excel 2013 进行数据整理，采用IBM SPSS 19 0 软件进行试验数据统计分析(=0.05)，采用 Origin 2021 进行图形绘制。2结果与分析2 1钼与氮形态对不同氮效率冬小麦根系氮组分含量的影响由表 2 可知，单一硝态氮处理和硝铵组合处理下，周麦 28、洛麦 34 均表现为亚硝态氮含量 铵态氮含量 硝态氮含量，而在单一铵态氮处理下 2 个基因型小麦均呈亚硝态氮含量 硝态氮含量 铵态氮含量。在单一硝态氮处理和
16、硝铵组合处理供应条件下，与 Mo 处理相比，+Mo 处理均降低了 2 个基因型小麦的硝态氮含量，而周麦 28 比洛麦 34 变幅更大。然而，与硝态氮含量含量相比，Mo 的施用增加了 2 个氮效率基因型冬小麦的亚硝态氮含量和铵态氮含量，这表明 Mo 在硝态氮同化途径中起着重要作用。表 2钼与氮形态对不同氮效率冬小麦叶片氮组分含量的影响mol/g氮素处理施 Mo处理周麦 28洛麦 34硝态氮含量亚硝态氮含量铵态氮含量硝态氮含量亚硝态氮含量铵态氮含量NO3 Mo3897 419a2 23 0 21c747 056d3556 531a179 011c634 0 81d+Mo2815 427bc2 74 0 32bc891 105cd2884 278a252 035b819 0 77cdNO3NH+4 Mo3304 325ab3 33 0 43b1079 122c2803 371a259 021b901 0 65c+Mo2142 214c4 52 0 54a1368 131ab2163 173b418 053a1284 1 37bNH+4 Mo180 023c0 35 0 05d1342 104
