1、2023 年 第 1 期 化学工程与装备 2023 年 1 月 Chemical Engineering&Equipment 223 三种提取方法测定地表水中叶绿素三种提取方法测定地表水中叶绿素 a a 的比较的比较 杨萍萍，王秀兰（云南省生态环境厅驻大理州生态环境监测站，云南 大理 671000）摘摘 要：要：分别选用传统手工研磨法、机器研磨法、超声波细胞破碎提取法 3 种方法提取水体中叶绿素 a，进行叶绿素 a 含量的测定,比较探讨三种方法的优劣性。结果表明，机器研磨提取法对地表水中叶绿素 a的提取率高于其他方法。其操作过程简便，损耗较低，实验操作人员与丙酮的接触时间短，更具有安全性。关键
2、词：关键词：地表水；叶绿素 a；提取；手工研磨；机器研磨；超声波 叶绿素是光合作用过程中重要的光合色素，藻类是水体中主要的初级生产者，为整个水域生态系统提供能量来源。叶绿素 a 是绝大多数藻类的光合反应中心色素。1通过测定水体中叶绿素含量，可以掌握水体的初级生产力。在湖泊富营养状态评价中，叶绿素 a 是重要的指标之一。因此，准确、高效、快速测定水体中叶绿素 a 含量是合理评价水体营养状态的基础。23 目前测定叶绿素 a 的方法主要包括分光光度法、荧光法和高效液相色谱法（HPLC）。分光光度法因操作简便、可靠性强被广泛应用于实验室分析测定；荧光法多应用于现场测定或在线监测；色谱法可进一步区分各种
3、色素混合体，但由于仪器精密昂贵，分析操作步骤繁琐而未被广泛应用。3-6在地表水环境监测领域，国标法 水质 叶绿素 a 的测定 分光光度法（HJ897-2017）应用最广泛。7 叶绿素对光、热和酸敏感，性质不稳定，遇酸时中心金属镁被氢置换脱离成暗绿至暗褐色的脱镁叶绿素。3分光光度法测定叶绿素 a 时，细胞破碎提取叶绿素 a 的方法亦很关键。目前细胞破壁技术主要有研磨、超声波破碎、低温室温反复冻融等。89 目前，国标法测定地表水叶绿素 a 大多采用传统手工研磨进行提取，存在耗时长，人员操作误差较大、研磨过程中操作人员与丙酮接触时间长，不利于实验人员的健康等不足。10因此对提取方法进行优化，分别选用
4、传统手工研磨法、机器研磨珠研磨法、超声波细胞破碎法，进行叶绿素 a 提取及含量测定。采用数据统计分析，从提取效果、精密度、操作的简便性等方面对三种提取方法进行比较。1 1 材料和方法材料和方法 1.1 材料 1.1.1 仪器设备 Whatman 玻璃纤维滤膜（0.47m）、抽滤装置、抽滤瓶、真空泵、研钵、超声波细胞粉碎机、氧化锆研磨珠式研磨仪、台式离心机、具塞刻度离心管（10ml）、紫外可见分光光度计、0.45m 聚四氟乙烯有机相针式过滤器、冰箱、移液枪、烧杯、滤纸、试管架、1cm 比色皿等。1.1.2 试剂 90%丙酮、1%碳酸镁悬浊液、去离子水。1.2 实验方法 1.2.1 样品采集与保存
5、 于洱海及上游湖库选取 10 个点位进行采样。使用有机玻璃采水器采集水面下 0.5m 样品，保存于 2.5 L 黑色聚乙烯采样桶中。为防止酸化引起色素分解，样品采集后立即加入 1%碳酸镁（每升样品加 1ml 碳酸镁悬浊液），避光阴凉处保存。1.2.2 样品浓缩 样品采集后当天于实验室进行抽滤处理，准确量取 500 ml 混匀水样，用 0.47m 玻璃纤维滤膜进行抽滤，再用少量去离子水清洗滤器壁，在样品刚刚完全通过滤膜时结束抽滤，用镊子取下滤膜，将有样品的一面对折，用滤纸吸干滤膜水分。1.2.3 叶绿素 a 的提取（1）手工研磨提取法 将滤膜剪碎，放入研钵中，加入 3ml-4ml 90%的丙酮溶
6、液，磨成糊状。补加 3ml-4ml 90%丙酮溶液,继续研磨，保证充分研磨 5min 以上。将完全破碎后的细胞提取液转移至离心管，用丙酮溶液冲洗研钵及研钵杵一并转移至离心管中，定容至 10ml。（2）机器研磨珠提取法 将滤膜对折后置于具塞刻度离心管中，用 90%丙酮溶液定容至 10 ml 后加入 5 颗不同大小的氧化锆研磨珠。将离心管置于研磨仪中，在 65Hz 的频率下振动研磨 90s。（3）超声波细胞破碎提取法 滤膜剪碎后，放入 10ml 离心管，加入 5ml 90%丙酮，使碎片浸入液面下。采用 2 次 10min 破碎,2将离心管置于冰浴中，放入超声仪器，在 100Hz 的频率下用超声波对
7、样品进行细胞破碎 10min。再加入 5ml 90%丙酮，摇匀后进行第二次 10min 破碎。DOI:10.19566/35-1285/tq.2023.01.050224 杨萍萍：三种提取方法测定地表水中叶绿素 a 的比较 将离心管中的提取液充分振荡混匀后，于 4 下避光浸泡提取 12 h，在浸泡过程中颠倒混匀 3 次。用离心机以4000 r/min 离心 10 min，用针式过滤器过滤上清液得到叶绿素 a 的丙酮提取液（试样）待测。1.2.4 试样测定与计算 将用不同方法制备的试样置于 1cm 比色皿中，以 90%丙酮溶液为参比溶液，于波长 750nm、664nm、647nm、630nm测量
8、吸光度，将测试结果代入式中进行计算。()()()VVAAAAAAChla1750630750647750664.08.054.185.11-=式中，Chla 为叶绿素 a 含量，g/L；V1为试样的定容体积，ml；V 为取样体积，L。1.3 结果统计分析方法 统计分析采用 环境水质监测质量保证手册 中回归分析11，计算相对偏差、回归方程、回归系数（R2），检验各方法之间的差异性，相关性。2 2 实验结果实验结果 2.1 测定结果比较 3 种方法对各个点位的测定结果均较一致，但具体数值有小幅差异，不同的实验方法测定结果见表 1。大部分样点的测定结果中，机器研磨法测定的叶绿素 a值最高，部分样点测
9、值与其他方法持平。（图 1）超声波破碎提取法部分点位测定结果相对偏低，致使超声波破碎法与其它方法相对偏差高于 20%。表表 1 1 叶绿素叶绿素 a a 不同提取方法测定结果不同提取方法测定结果 提取方法 叶绿素 a 测值（g/L)Xz Tc Xh Gy Hc Ts Xy Hs Sp Sc 人工研磨 3 5 37 4 16 7 9 2 11 6 机器研磨 4 6 45 4 18 10 9 3 12 7 超声波破碎 4 6 39 2 11 6 9 2 6 4 相对偏差（人工-机器）14%9.1%9.8%0.0%5.9%18%0.0%20%4.3%7.7%相对偏差（人工-超声波）14%9.1%2.
10、6%33%18%7.7%0.0%0.0%29%20%相对偏差（超声波-机器）0.0%0.0%7.1%33%24%25%0.0%20%33%27%图图 1 1 叶绿素叶绿素 a a 不同提取方法测定结果不同提取方法测定结果 2.2 提取耗时比较 人研磨每次处理一个样品，研磨耗时约为 10min；机器研磨每次最多能处理 8 个样品，每批样品操作耗时约 3min；超声波破碎每次处理一个样品，由于需进行两次超声，提取耗时约 23min。机器研磨珠研磨提取法操作时间较短，可同时处理多个样品，从提取时间及操作的简便性方面，较其余两种方法具有较大优势。2.3 统计分析 三种方法之间均均有显著相关性。其中，人
11、工研磨提取法与机器研磨提取法测定结果之间具有较强的相关性，回归系数高于人工研磨法与超声波破碎法、机器研磨法与超声波破碎法测定结果。表表 2 2 测定结果比较测定结果比较 方法 N pearson 相关系数 显著性差异检验 人工研磨-机器研磨 10 0.996 0.000 人工研磨-超声波破碎 10 0.976 0.000 机器研磨-超声波破碎 10 0.982 0.000 杨萍萍：三种提取方法测定地表水中叶绿素 a 的比较 225 将人工研磨测定叶绿素a与机器研磨测定叶绿素a的结果进行比对（图 2），人工研磨法与机器研磨法提取叶绿素 a的测定结果呈正相关，线性关系为229.02029.1-=x
12、y，回归系数993.02=R。图图 2 2 人工研磨法与机器研磨法叶绿素人工研磨法与机器研磨法叶绿素 a a 的测定结果的测定结果 将人工研磨测定叶绿素 a 与超声波破碎提取测定叶绿素 a 的结果进行比对（图 3），人工研磨法与超声波破碎提取法叶绿素 a 的测定结果呈正相关，线性关系为4106.10311.1-=xy，回归系数9518.02=R。图图 3 3 人工研磨法与超声波破碎法叶绿素人工研磨法与超声波破碎法叶绿素 a a 的测定结果的测定结果 图图 4 4 机器研磨法与超声波破碎法叶绿素机器研磨法与超声波破碎法叶绿素 a a 的测定结果的测定结果 将机器研磨测定叶绿素 a 与超声波破碎提
13、取测定叶绿素 a 的结果进行比对（图 4），机器研磨法与超声波破碎法提取叶绿素 a 的测定结果呈正相关，线性关系为2418.18598.0-=xy，回归系数9638.02=R。3 3 结果与讨论结果与讨论 机器研磨提取法对地表水中叶绿素 a 的提取率高于人工研磨提取法和超声波细胞破碎提取法。超声波破碎提取法部分点位测定结果相对偏低，提取过程有损耗。传统手工研磨提取法研磨过程耗时费力、步骤烦琐，不易将样品细胞完全磨碎，致使提取不充分。经多次研磨、洗涤、转移还会造成样品损耗。且丙酮具有神经毒性，易挥发，实验人员操作时间过长，不利于操作人员的健康。机器研磨珠提取法相较于传统手工研磨、超声波细胞破碎法
14、对地表水中叶绿素 a 提取更完全。该方法操作简便，避免了研磨和转移过程的损耗；在提取过程中缩短受光照影响的时间，降低叶绿素 a 的光降解。可同时处理多个样品，有效提高实验效率；操作者不必长时间暴露于丙酮的挥发气体中，对操作人员更加安全。超声波细胞破碎提取法操作简便，实验人员与丙酮接触较少，安全性相对较高。但超声波破碎细胞过程会产生热量，必须于冰浴下进行，仍不可避免部份叶绿素 a 因温度过高而分解损耗，致使部分点位测定结果相对偏低。且每次只能处理一个样品，提取过程耗时相对较长，在操作过程中存在一些不稳定因素，尚需进一步优化。参考文献参考文献 1 韩博平,韩志国,付翔.藻类光合作用机理与模型M.北
15、京:科学出版社,2003.2 超声破碎法在叶绿素a 测定中的应用C/2013中国环境科学学会学术年会论文集(第四卷),2013:527-531.3 徐彩平,刘霞,陈宇炜.浮游植物叶绿素 a 浓度测定方法的比较研究J.生态与农村环境学报,2013,29(04):438-442.4 刘苑,陈宇炜,邓建明.YSI(多参数水质检测仪)测定叶绿素 a 浓度的准确性及误差探讨J.湖泊科学,2010,22(06):965-968.5 王康,凌彦群.分光光度法测定叶绿素 a 方法比较C/第十六届中国科协年会分 5 生态环境保护与绿色发展研讨会论文集,2014:160-163.6 杨琳.浮游植物叶绿素 a 测定
16、方法研究进展J.四川环境,2019,38(01):156-160.7 环境保护部.水质 叶绿素 a 的测定 分光光度法：HJ 897-2017EB/0L.2017.8 翁笑艳,林美爱,严颖.地表水浮游植物叶绿素 a 测定方法比较研究J.中国环境监测,2009,25(03):36-38+76.9 胡秉芬,黄华梨,季元祖,等.分光光度法测定叶绿素含量的提取液的适宜浓度J.草业科学,2018,35(08):1965-1974.10 王曼.浮游植物叶绿素 a4 种提取方法的比较J.中国实用医药,2013,22(08):263-264.11 中国环境监测总站.环境水质监测质量保证手册M.北京:化学工业出版社,1984.
