1、 157 研究探讨食品工业 2023 年第44卷第 1 期上海口岸分离单增李斯特菌耐药性及MLST分型研究黄新新1，何宇平1*，宁雪1，赵勇2，郭德华1，曾静31.上海海关动植物与食品检验检疫技术中心（上海 200135）；2.上海海洋大学食品学院（上海 201306）；3.中国海关科学技术研究中心（北京 100026）摘要研究口岸进口食品及上海本地食品和加工环节中分离的单增李斯特菌耐药特性及多位点序列分型(multilocus sequence typing,MLST)分型。使用微量肉汤法检测47株菌株的耐药性,采用全基因测序法对47株菌株测序,将拼接好的序列与数据库比对,进行MLST分型。
2、结果表明47株菌株对氨苄西林、青霉素、复方新诺明、万古霉素、庆大霉素、头孢唑林、美罗培南100%敏感,对头孢西丁100%耐药。对苯唑西林耐药率87.23%(41/47);红霉素耐药率4.25%(2/47);克林霉素中介率74.46%(35/47);环丙沙星耐药率6.38%(3/47),中介率8.51%(4/47);达托霉素中介率2.12%(1/47);四环素耐药率2.12%(1/47);氯霉素耐药率10.63%(5/47),中介率12.76%(6/47)。2株四重耐药,6株三重耐药。47株菌分为17个序列型(sequence type,ST),17个克隆群(clonal complex gro
3、ups,CC),并有一株新ST型(LM63),该菌株的dat是一个新的等位基因。其中25株(53.2%)属于家系、21株(44.7%)属于家系,优势ST型是ST2、ST87、ST9。来自欧洲及美洲的ST型呈现多样化,来自中国的菌株,主要为ST 9、ST 87和ST 101型。鉴于这些特征,需加强口岸进口食品中单增李斯特菌的监管力度,以减低安全风险,有效保障食品安全。关键词单增李斯特菌;多位点序列分型;耐药性 Antibiotic Resistance and MLST Typing of Listeria monocytogenes Isolated at Shanghai PortHUANG
4、 Xinxin1,HE Yuping1*,NING Xue1,ZHAO Yong2,GUO Dehua1,ZENG Jing31.Technical Center For Animal,Plant and Food Inspection and Quarantine of Shanghai Customs(Shanghai 200135);2.College of Food Science and Technology,Shanghai Ocean University(Shanghai 201306);3.Science and Technology Research Center of C
5、hina Customs(Beijing 100026)Abstract To analyze the antibiotic resistance and MLST typing of Listeria monocytogenes isolated from imported food at ports and local food and processing links in Shanghai.Detection of antibiotic resistance for 47 strains by micro broth method,all strains were sequenced
6、by whole gene sequencing,and the spliced sequences were compared with the database for MLST typing.The results reviewed that 47 strains were 100%sensitive to ampicillin,penicillin,cotrimoxazole,vancomycin,gentamicin,cefazolin and meropenem,and 100%resistant to cefoxitin.The resistance rate to oxacil
7、lin was 87.23%(41/47);Erythromycin resistance rate was 4.25%(2/47);The intermediary rate of clindamycin was 74.46%(35/47);The resistance rate of ciprofloxacin was 6.38%(3/47),and the intermediary rate was 8.51%(4/47);The mediation rate of daptomycin was 2.12%(1/47);Tetracycline resistance rate was 2
8、.12%(1/47);The resistance rate of chloramphenicol was 10.63%(5/47),and the intermediary rate was 12.76%(6/47).Two strains were quadruple resistant and six strains were triple resistant.The 47 strains were divided into 17 sequence types(ST),17 clone complex groups(CC),and a new st type(lm63).The dat
9、of this strain was a new allele.Among them,25 strains(53.2%)belong to family I,21 strains(44.7%)belong to family II,and the dominant st types were ST2,st87 and ST9.ST forms from Europe and America were diverse,and strains from China were mainly ST 9,ST 87 and ST 101.According to these characteristic
10、s,it is necessary to strengthen the supervision of Listeria monocytogenes in imported food at ports in order to reduce safety risks and effectively ensure food safetyKeywords Listeria monocytogenes;Multilocus sequence typing;antibiotic resistance*通信作者；基因项目：上海市科技兴农项目（2019-02-08-00-10-F01149），上海市自然科学基
11、金（19ZR1417400），上海市科委农业科技领域项目（21N31900300）单增李斯特菌（Listeria monocytogenes）为重要的食源性致病菌，对免疫力低下的人群例如孕妇、老人及儿童等尤为易感，可引发脑膜炎、败血症及流产，死亡率高达30%1。上海口岸每年进口大量各类冰鲜及冷冻食品，来自挪威、智利的大西洋鲑鱼、北极贝等冰鲜食品因其口味鲜美而广受欢迎。然而单增李斯特菌除广泛存在于各类食品中，在4 保存的食物中也可生长繁殖，这对用作生食的冰鲜刺身带来很大风险，加之其能抵御冷冻等各种严苛条件，造成食品安全的重大隐患2。研究基于口岸进出口食品风险食品工业 2023 年第44卷第 1
12、期 158 研究探讨监管的需求，检测从东亚、欧洲、南美及北美冰鲜和冷冻食品中分离到的单增李斯特菌耐药性，结合全基因测序分析各菌株的多位点序列分型（multilocus sequence typing，MLST），旨在了解世界各地单增李斯特菌耐药发展趋势及分布规律。提升政府监管力度，保障食品安全。1材料与方法1.1菌株47株单增李斯特菌分离株来源于欧洲、南美、北美、东亚及中国上海各地，分离自大西洋鲑鱼、巴氏鱼柳、鸡翅、猪耳及上海食品加工厂生产环节中的食品或环境样品，经实验室分离鉴定。药敏质控菌株金黄色葡萄球菌ATCC29213购自美国ATCC菌株保藏中心。所有菌株-80 保存于10%甘油肉汤中。
13、1.2仪器与试剂全自动药敏试验菌液接种及判读系统（珠海美华医疗科技有限公司，型号：MA120）；高速冷冻离心机（德国Eppendorf公司，型号：5427R）；细菌药物MIC测试板及M-H肉汤培养基（珠海美华医疗科技有限公司）；细菌基因组DNA抽提试剂盒（大连宝生物工程有限公司）；缓冲蛋白胨水（BPW）、脑心浸液营养肉汤、李氏增菌（LB1，LB2）基础（北京陆桥技术有限责任公司）；李斯特菌显色培养基（上海中欣生物工程有限公司）。1.3方法1.3.1菌株复苏从甘油冻存管中取100 L菌液接种到5 mL脑心浸液营养肉汤中，在37 条件下，按150 r/min振荡过夜。1.3.2药敏试验菌悬液制备：
14、挑取纯培养单个菌落于稀释液瓶内壁研磨，呈细菌悬液0.5麦氏单位，可以参照标准比浊管，也可以用浊度计测量。吸50 L菌悬液，加至M-H肉汤培养基内混匀后，加入测试板药敏孔，每孔100 L。贴好膜，3537 孵育1824 h后判读结果。测试板中的药物种类：1.氨苄西林（ampicillin，AM）；2.青霉素（penicillin，PEN）；3.苯唑西林（oxacillin，OXA）；4.红霉素（erythromycin，ERY）；5.克林霉素（clindamycin，CLI）；6.环丙沙星（ciprofloxacin，CIP）；7.达托霉素（daptomycin，DAP）；8.复方新诺明（tri
15、methoprim sulfamethoxazole，SXT）；9.万古霉素（vancomycin，VA）；10.四环素（tetracyclines，TET）；11.氯霉素（chloramphenicol，CHL）；12.庆大霉素（gentamicin，GEN）；13.头孢西丁（cefoxitin，CXT）；14.CFZ头孢唑林（cefazolin，CFZ）；15.美罗培南（meropenem，MER）。药敏判定参照了美国临床实验室标准化研究所（Clinical and Laboratory Standard Institute，CLSI）标准：CLSI M100 ED31-2021，以金黄色
16、葡萄球菌为参照判定标准。1.3.3基因组抽提利用试剂盒进行基因组DNA抽提，采用琼脂糖凝胶电泳进行DNA完整性和纯度检测，采用Qubit 3.0进行DNA浓度检测，提取后的DNA送上海生工生物工程股份有限公司。1.3.4建库测序利用超声波仪 Covaris M220（Covaris，Woburn，MA，USA）将各基因组DNA样本随机打断成300 bp左右的片段，随后按照操作说明书，利用NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina（NEB，USA）进行文库构建，采用Agencourt AMPure XP（Beckman，USA）进行磁珠纯化，并用GenNextTM NGS Library Quantification Kit（Toyobo，Japan）进行定量，之后采用illumina平台进行测序。1.3.5MLST分析用拼接好的序列（scaffolds）和mlst的数据库（指定的方案）进行比对，得到每个样本的分型。分析工具：mlst分型和最小生成树可视化使用R语言（v3.6.3）工具包MLSTar（version 0.1.5）（htt
