1、基金项目国家自然科学基金项目（81960363）；云南省地方本科高校基础研究联合专项资金项目（202001BA070001-040）；云南省高层次卫生计生技术人才培养项目（H-2019045）收稿日期2022-08-01第一作者简介程明璟，硕士研究生，主要从事临床微生物感染与免疫研究。*通信作者：赵卫东，副教授，博士，E-mail：。幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，H.pylori）感染与胃炎、消化性溃疡、淋巴瘤和胃癌等疾病相关，全球每年新发胃癌病例中约 60%与 H.pylori 慢性感染相关1-2。因此，H.pylori 慢性感染的防治已成为国内外研究的热点问题。深入研
2、究 H.pylori 慢性感染机制，根除 H.pylori 感染，是预防胃癌的重要方法3。针对 H.pylori 慢性感染的免疫学机制探讨根除 H.pylori 感染的有效治疗方法，是国内外感染与免疫学领域面临的重大课题。近年来，借助生物信息学分析方法寻找各类疾病发生、发展过程中重要的靶标分子已经成为生物医学领域新的研究热点4。基于此，本研究利用公开发表数据库中 H.pylori 感染的相关数据资料，借助生物信息学方法分析 H.pylori 感染过程中发生显著变化的核心基因及其影响的重要生物学过程，以期为 H.pylori 感染的根除以及对胃癌的防治提供理论参考。1材料与方法1.1数据收集利用
3、关键词“Helicobacter pylori”“Homo sapiens”在美国国家生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）创建的基因表达综合（Gene Expression Omnibus，GEO）数据库（https：/www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）进行检索，共检索到 665 个数据集，经筛选后，3 个数据集（GSE6143、GSE60427、GSE60662）成为目标数据集，随后下载 3 个数据集的基因表达文件，其中，GSE6143 数据集来源于 GPL193 测序平台，共包括24 个样本
4、（8 个 H.pylori 阴性样本，16 个 H.pylori阳性样本）；GSE60427 数据集来源于 GPL17077 测序平台，共包括 32 个样本（8 个 H.pylori 阴性样本，24 个 H.pylori 阳性样本）；GSE60662 数据集来源于GPL13497 测序平台，共包括 16 个样本（4 个 H.pylori 阴性样本，12 个 H.pylori 阳性样本）。1.2差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs）的筛选利用 NCBI 网站提供的在线分析软件 GEO2R 对 GSE6143、GSE60427 和 GSE60662
5、数据集进行 DEGs 分析，分析时以 H.pylori 阴性样本为对照组，H.pylori 阳性样本为实验组，并计算出每个基因变化倍数的绝对值（|lgFC|）和校正 P 值，当基因同时满足|lgFC|1.0 和 P0.4 时，认为 2个蛋白质之间存在相互作用；利用 Cytoscape 软件分析配对蛋白质，并计算每个蛋白质的度值，当度值5 分时，将其确定为重要蛋白质。2结果2.1DEGs 筛选结果以基因表达|lgFC|1.0 和P 0.05 为 筛 选 标 准，GSE6143、GSE60427 和GSE60662 中分别有 178 个、256 个和 130 个 DEGs。利用韦恩图表示 3 个数
6、据集中共有的 DEGs，共筛选到 29 个核心基因，分别为 IFNAR2、TRAF1、ICAM1、CASP1、TLR4、TGFB1、ENG、CCL19、CXCL3、CR2、C3、EMP3、ICAM3、CCL4、MFNG、GATD3A、ATP2A3、IGF1R、PTPN21、PTPN14、DKK3、HDAC5、FGFR4、PAK1、BAG1、IL1RL2、TLR5、PTPN9 和 IL9R。见图 1。图 1核心基因筛选韦恩图2.2核心基因的KEGG 通路富集分析为进一步探索 29 个核心基因的通路富集情况，对其进行了KEGG 通路富集分析，富集结果显示，核心基因主要涉及军团菌病、疟疾、核因子 B
7、（nuclear factor-B，NF-B）信号通路、炎症性肠病、类风湿性关节炎、利什曼病和百日咳等方面。见表 1。表 1核心基因的 KEGG 通路富集情况2.3核心基因的 GO 分析为了进一步探索 29 个核心基因的特性及其生物学功能，对其进行了 GO分析，包括细胞组成分析、生物过程分析和分子功能分析。细胞组成分析结果显示，核心基因主要存在于蛋白激酶复合物、转移酶复合物、血小板致密管状网络膜、血小板致密管状网络和肌浆网膜中；生物过程分析结果显示，核心基因主要参与补体激活替代途径、心内膜垫形成的上皮向间充质转化的调节、细胞对转化生长因子 刺激的反应调节、核质转运的调节和细胞外基质分解的调节等
8、过程；分子功能分析结果显示，核心基因的分子功能包括型转化生长因子 受体结合、型转化生长因子 受体结合、半胱氨酸型内肽酶激活剂活性参与凋亡过程、成纤维细胞生长因子激活受体活性和干扰素受体活性等。见表 2。2.4PPI 网络分析为进一步了解核心基因所表达蛋白质之间的相互关系，使用在线软件 STRING 对其进行 PPI 网络分析。见图 2A。根据度值高低进行排序，度值越高表明与之相关联的蛋白质数量越多，其在 PPI 网络中越重要。PPI 网络分析结果显示，排名第 1 位的蛋白质为 TLR4（度值为 13），第 2位至第 13 位的蛋白质依次为 ICAM1（度值为 12），CCL4（度值为 7），T
9、LR5、CCL19、CR2（度值均为 5），通路名称P分值军团菌病4.28e-061.79疟疾0.002 91.64NF-B 信号通路3.32e-061.60炎症性肠病0.005 11.53类风湿性关节炎0.000 71.50利什曼病0.005 71.46百日咳0.005 71.44Toll 样受体信号通路0.001 11.43胞质 DNA 传感通路0.004 71.34病毒蛋白与细胞因子和细胞因子受体的相互作用0.007 81.32GSE614327935229470105GSE60427GSE60662大理大学学报总第 86 期自然科学323讨论本研究通过分析公共数据库中 H.pylori
10、 感染相关的数据资料，筛选出 H.pylori 感染者与未感染者之间的 DEGs，并对这些 DEGs 进行了 KEGG 通路富集分析和 GO 分析。分析结果显示，H.pylori 感染机体后激活了炎症免疫反应。在 PPI 网络分析中发现 H.pylori 感染机体后趋化因子（如 TLR4、ICAM1、CCL4、TLR5、CCL19、CR2 等重要蛋白质）较为活跃。TLR4，又称 Toll 样受体 4，是 Poltorak 等于1998 年发现的，可作为脂多糖、脂磷壁酸等病原相关分子模式受体，进一步激活天然免疫反应5。TLR4被认为参与了多种疾病的发生、发展，Hu 等6通过泛癌研究发现 TLR4
11、 的表达与胃癌、肾透明细胞癌、黑色素瘤和子宫内膜癌患者预后相关。此外，TLR4 亦可通过激活 JNK 信号通路促进肝脏炎症反应7。在 H.pylori 感染中，TLR4 介导了机体对 H.pylori的识别，并引起宿主的抗 H.pylori 免疫反应8。在TLR4 基因多态性研究方面，rs4986790 多态性可显著增加 H.pylori 感染风险9，而 rs1057317 多态性亦TGFB1、CASP1、CXCL3（度值为 4），C3、ENG（度值均 为 3），ICAM3、TRAF1（度 值 均 为 2）。使 用Cytoscape 软件将度值5 分的重要蛋白质进行可视化展示，相互作用关系见图
12、 2B。表 2核心基因的 GO 分析情况细胞组成分数生物过程分数分子功能分数蛋白激酶复合物546补体激活替代途径2 978型转化生长因子 受体结合2 411转移酶复合物387心内膜垫形成的上皮向间充质转化的调节2 410型转化生长因子 受体结合2 013血小板致密管状网络膜387细胞对转化生长因子 刺激的反应调节1 329半胱氨酸型内肽酶激活剂活性参与凋亡过程963血小板致密管状网络296核质转运的调节1 178成纤维细胞生长因子激活受体活性879肌浆网膜85细胞外基质分解的调节963干扰素受体活性879夹层圆盘74跨膜受体蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶信号通路的调控931白细胞介素-1 受体活性87
13、9质膜51受体介导的病毒粒子附着到宿主879CCR1 趋化因子受体结合879肌浆网45心房心肌组织形态发生879CCR5 趋化因子受体结合879细胞接触区42RNA 对基因沉默的负调控879肽酶激活剂活性参与凋亡过程809质膜细胞质侧34心脏形态发生的细胞增殖调控879转化生长因子 受体结合748图 2核心基因表达蛋白的 PPI 网络分析AB注：A 为 PPI 网络中排名前 13 的蛋白质；B 为 PPI 网络中度值5 分的重要蛋白质。程明璟，严萍，樊玉娟，等生物信息学分析幽门螺杆菌感染差异基因表达情况总第 86 期第 8 卷33可明显增加 H.pylori 感染所致的胃癌发生风险10。ICA
14、M1，又称细胞间黏附分子 1 或 CD54，主要参与细胞信号转导、细胞生长、炎症和血管生成，对白细胞活化及迁移具有重要作用11。因此，ICAM1被认为参与了多种癌症的转移和浸润，包括乳腺癌12、前列腺癌13和结直肠癌14等。早在 2002年，Innocenti 等15发现 H.pylori 感染后可显著促进黏附相关因子 ICAM1 的表达。随后，De Jesus等16研究也表明 H.pylori 的尿素酶会引起 ICAM1表达升高，而 ICAM1 进一步促进了 H.pylori 对胃黏膜的黏附。CCL4，又称巨噬细胞炎性蛋白 1，主要由活化的单核细胞分泌，可趋化淋巴细胞至炎症部位。在多种癌症中
15、 CCL4 亦可通过招募细胞毒 T 淋巴细胞而加强抗肿瘤免疫17。此外，有研究18发现 H.pylori 感染后胃黏膜中的 CCL4 表达明显增强，并且CCL4 升高水平与感染部位炎症细胞浸润高度相关。TLR5，又称 Toll 样受体 5，其是识别鞭毛蛋白的主要胞外受体。H.pylori感染后，其菌毛相关蛋白CagY可活化 TLR5，从而引起机体的固有免疫反应19。而 H.pylori 的菌毛蛋白 FlaA 可逃避 TLR5 介导的先天免疫反应20。在胃活检组织中，Pachathundi-kandi 等21发现 TLR5 表达与 H.pylori 感染和胃黏膜病变相关。CCL19，又称巨噬细胞
16、炎性蛋白 3，主要由次级淋巴组织中的 T 淋巴细胞分泌，可趋化成熟树突状细胞和幼稚 T 淋巴细胞。H.pylori 感染后，胃黏膜细胞分泌 CCL19，趋化 CCR7+树突状细胞至淋巴结，最终诱导特异性免疫反应22。而 CCL19 在 H.pylori 感染相关胃癌中的研究较少，仍需进一步探究。CR2，又称型补体受体，分布于单核细胞和 B细胞表面，主要调节 B 细胞的增殖和分化，此外也是EB 病毒的受体23。目前，虽然关于 CR2 与 H.pylori感染之间的直接研究较少，但是有学者发现 H.pylori感染可促进 EB 病毒对胃黏膜细胞的黏附24，具体机制仍有待研究。综上所述，H.pylori 感染机体后引起机体免疫反应，尤其是机体固有免疫反应。同时 TLR4、ICAM1、CCL4、TLR5、CCL19 和 CR2 在 H.pylori 感染相关疾病中也发挥了重要作用，可为进一步研究H.pylori 感染相关疾病提供参考。参考文献1 YAN P，YU B，LI M，et al.Association betweenNonalcoholic Fatty Liver Disease a
