1、中 国 组 织 化 学 与 细 胞 化 学 杂 志CHINESE JOURNAL OF HISTOCHEMISTRY AND CYTOCHEMISTRY第 31 卷第 6 期2022 年 12 月Vol.31.No.6December.2022收稿日期2021-12-25 修回日期2022-12-02基金项目国家自然科学基金青年项目（81700653）作者简介胡芝芝，女(1984 年)，汉族，主治医师*通讯作者(To whom correspondence should be addressed)：肾缺血再灌注损伤小鼠肾内纤维化和胆绿素还原酶阳性巨噬细胞增加胡芝芝，裴广畅，曾锐*，徐钢（华中科
2、技大学同济医学院附属同济医院肾内科，武汉 430030）摘要目的 通过研究肾缺血再灌注损伤时肾组织中胆绿素还原酶（biliverdin reductase,BVR）的表达与巨噬细胞的关系，为进一步研究BVR与巨噬细胞在肾脏纤维化中的作用提供依据。方法 16只C57BL/6雄性小鼠随机分为假手术组（Sham组）和肾脏缺血再灌注组（ischemia-reperfusion injury，IRI 组），取肾组织切片行 PAS、Masson、Sirius red 染色，免疫组织化学检测-SMA、PDGF-和 Collagen IV 的表达，RT-PCR 检测-SMA、FN、Collagen I 和 K
3、IM-1 mRNA 表达，流式细胞术和免疫荧光染色检测 BVR 与巨噬细胞的关系。结果 在缺血再灌注小鼠损伤肾组织内，PAS 染色发现 IRI 组肾小球硬化明显，系膜细胞增生，肾小管管腔扩张，小管上皮细胞肿胀或发生空泡变性、细胞脱落、基膜裸露。Masson 和 Sirius Red 染色发现肾间质胶原纤维表达明显增加；免疫组织化学染色显示 IRI 组-SMA、PDGF-和 collagen IV 免疫反应性增强，RT-PCR 检测显示 IRI 组-SMA、FN、collagen I 和 KIM-1 mRNA 水平增高；流式细胞术检测发现，在肾缺血再灌注小鼠，血液、骨髓和肾组织 BVR 阳性巨噬
4、细胞显著增加，免疫荧光双标进一步证实缺血再灌注肾损伤组织 BVR 阳性巨噬细胞明显增多。结论 BVR 阳性巨噬细胞参与肾缺血再灌注损伤后肾纤维化过程。关键词肾缺血再灌注损伤；胆绿素还原酶；巨噬细胞；肾纤维化中图分类号R365 文献标识码A DOI：10.16705/ki.1004-1850.2022.06.003Increase in fibrosis and biliverdin reductase positive macrophages in the kidney of mice with renal ischemia-reperfusion injuryHu Zhizhi,Pei Gu
5、angchang,Zeng Rui*,Xu Guang(Division of nephrology,Department of internal medicine,Tongji Hospital,Tongji Medical College,Huazhong University of Science and Technology,Wuhan 430030,China)AbstractObjective By studying the relationship between the expression of biliverdin reductase(BVR)in renal tissue
6、 and macrophages during renal ischemia-reperfusion injury,to provide a basis for further study on the role of BVR and macrophages in renal fibrosis.Methods Sixteen C57BL/6 male mice were randomly divided into two groups:sham operation group(Sham group,n=8),renal ischemia-reperfusion injury group(IRI
7、 group,n=8).Kidney tissues were used for HE,Masson and Sirius red stains to assess histological changes,immunohistochemical detection of-SMA,PDGF-,Collagen I expression in ischemia-reperfusion injury group and sham operation group,RT-PCR method for-SMA,FN,Collagen I,KIM-1expression in IRI group and
8、Sham group,flow cytometry and immunofluorescence to detect the relationship between BVR and macrophages.Results Compared with the sham-op-erated group,in the ischemia-reperfusion model,renal interstitial fibrosis and inflammatory cell infiltration were significantly worse.Immunohistochemistry showed
9、 increased expression of-SMA,PDGF-and collagen IV in the IRI group.RT-PCR showed increased expression of-SMA,FN,Collagen I,and KIM-1 in the IRI group.In mice with renal ischemia-reperfusion injury,flow cytometry analysis found that the number of BVR positive macrophages in blood,bone marrow and kidn
10、ey tissue increased significantly,and the double immunofluorescence staining further confirmed the increase of BVR positive macrophages in the renal tissue.Conclusion BVR positive macrophages might participate in the process of renal fibrosis after renal ischemia-reperfusion injury.KeywordsRenal isc
11、hemia-reperfusion injury;biliverdin reductase;macrophage;renal fibrosis中国组织化学与细胞化学杂志552第 31 卷胆绿素还原酶（biliverdin reductase,BVR）是在亚铁血红素代谢途径中将胆绿素转化成胆红素的一种酶，分为BVR-A和BVR-B两个亚型。两个亚型都能够产生胆红素，只有BVR-A能够降低胆绿素转化成抗氧化分子胆红素1。BVR 以二聚体形式结合在DNA上，核定位信号和核输出信号具备一致性，以便BVR 将活化信号 ERK1/2 进行传递2。作为亮氨酸-拉链样转录因子，BVR结合到Ap-1位点，可以激
12、活HO-1 启动子转录，也可以抑制 tlr4 基因表达3。另外，BVR还具有丝氨酸/苏氨酸激酶和酪氨酸激酶活性，可以激活 IGF-1 和 MARK 途径1。在神经元中敲除 BVR 可以导致活性氧（reactive oxygen species,ROS）水平升高，降低神经元活性，增加 caspase 活性和促进凋亡3。我们的前期研究证实 BVR 能够利用酪氨酸蛋白激酶活性，激活 PI3K/Akt 信号途径，参与缺氧诱导的肾小管上皮细胞 EMT 过程4。巨噬细胞既是免疫效应细胞也是抗原呈递细胞，具有连接天然免疫和获得性免疫的作用。巨噬细胞可以分为 M1 亚型（经典激活）和 M2 亚型（选择激活）巨
13、噬细胞。在不同的环境中，巨噬细胞可以分化成不同亚型，呈现表型的异质性和多样性，发挥促炎和抗炎两种截然不同的作用。在急性肾损伤早期，巨噬细胞参与组织损伤，在随后的慢性修复期，巨噬细胞则呈现组织修复和促进纤维化的双重作用5-7。在缺血再灌注损伤模型中，通过注射氯膦酸盐脂质体清除巨噬细胞后，发现肾巨噬细胞浸润减少和纤维化减轻8。肾小管间质纤维化是慢性肾病发生发展过程中重要病理特征，而肾间质巨噬细胞浸润与肾损伤密切相关9。在RAW264.7巨噬细胞中，胆绿素（biliv-erdin,BV）刺激可以抑制 TLR4 的表达和促炎因子的释放，稳定敲除 BVR 则导致 TLR4 和 TNF-表达升高10，由此
14、提示BVR阳性巨噬细胞可能调节肾脏纤维化，参与肾纤维化病变过程。本文利用肾缺血再灌注损伤模型，检测肾缺血再灌注损伤时肾组织中 BVR 的表达与巨噬细胞的关系。材料与方法1 动物及主要试剂16 只体重 2025 g C57BL/6 雄性小鼠购于北京华阜康公司；兔抗小鼠 BVR 多克隆抗体购自美国Stressgen 公司；兔抗小鼠-SMA 多克隆抗体、兔抗小鼠 collagen I 多克隆抗体、大鼠抗小鼠 F4/80 多克隆抗体购自英国 Abcam 公司；兔抗小鼠 CD45-precp-cy5.5 抗体、兔抗小鼠 F4/80-PE 抗体、兔抗小鼠 CD11b-APC 抗体购自 eBioscienc
15、e 公司；Alexa Fluor488标记的山羊抗兔IgG、Cy3标记的山羊抗大鼠 IgG 和 DAPI 染色剂均购自碧云天公司；RT-PCR引物由美国 Invitrogen 公司合成，Trizol 试剂购于美国 Invitrogen 公司；免疫组织化学试剂盒、生物素标记二抗和DAB显色液购于上海基因科技公司；反转录试剂盒购于美国 Promega 公司，PCR 试剂盒购于德国 Qiagen 公司。2 主要仪器正置显微镜（CX23，Olympus），激光扫描共聚焦显微镜（FV3000，Olympus），RT-PCR 仪（Roche LightCycler 480），流式细胞仪（FACSCanto
16、 II，BD）。3 动物分组与模型建立16 只 C57BL/6 雄性小鼠随机分成假手术组（Sham 组）和肾缺血再灌注模型组（IRI 组）2 组，每组8只小鼠。以1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉（0.2 mL/100g）模型组小鼠，背部备皮，消毒，行背部正中切口，暴露左侧肾脏，分离肾包膜，夹闭左侧肾蒂30 min。30 min 后松开动脉夹，缝合皮肤及组织。4 标本留取Sham 组、IRI 组小鼠常规饲养 5 d、10 d 后，经小鼠眼内眦静脉取血，取手术侧肾脏称重，用生理盐水灌洗肾脏，至肾脏发白，留取 1/4 肾脏固定于4%多聚甲醛，用于制备石蜡切片，留取 1/4 肾脏行流式细胞术，其余组织-80 保存。5 组织化学染色模型制作 5 d 和 10 d 后处死 Sham 组和 IRI 组小鼠，取新鲜肾，去除包膜，以 4%多聚甲醛固定 24 h，常规石蜡包埋，3 m 切片，进行过苏木素-伊红（HE)染色、Masson 三色法染色和天狼星红（Sirius Red）染色。光镜下观察肾小球硬化及间质损害程度。6 免疫组织化学染色SABC 法免疫组织化学染色：新鲜肾去除包膜后，以 4多聚甲醛固定 24
