1、脑与神经疾病杂志年第卷第期？论著型通道阻断剂通过抑制炎症小体激活对诱导的小胶质细胞炎症模型发挥神经保护作用刘思昆陈曦许苗菁赵振强周畅许叶王琰【摘要】目的在诱导的帕金森（）细胞炎症模型中，使用型通道阻断剂伊拉地平对小胶质细胞进行干预，观察其炎症反应的影响探讨型通道阻断剂伊拉地平是否 可以调控炎症小体通路。方 法使用造模药物在小胶质细胞上制备炎症细胞模型，法分别检测不同浓度和伊拉地平处理后对的小胶质细胞具体活性影响，选择合适的药物实验浓度。将的小胶质细胞变为组，分别为空白对照组、造模组、伊拉地平预处理组和 预处理组（即 阳性对照组），采用实时的荧光定量检测小胶质细胞中、基因表达水平；细胞免疫 荧光
2、检测小胶质细胞中、蛋白表达水平；检测小 胶 质细胞、蛋白表达水平。结 果与 空白对照组相比，（？）能明显降低细胞活性，显著升高，、表达水平（）。与空白组比较，伊拉地平（？）干预后，减缓了导致的细胞活性降低（），？伊拉地平可显著降低、表达水平（），显著降低诱导的、蛋白表达水平。结论在炎症细胞模型中，型 通道阻断剂伊拉地平可能通过通路减轻了小胶质细胞炎症因子的表达。【关键词】伊拉地平；小胶质细胞；帕金森病中图分类号：文献标识码：文章编号：（），：，：（），（，），；（基金项目：国家自然科学基金项目（）；海南 省临床医学中心建 设项目资 助（）；海南 省自然科学基金高层 次人才 项目（）作者 单位：
3、海口，海南医学院热 带脑 科学研究与转化重点实验室（刘 思昆、陈曦、许 苗箐、赵振强、周 畅、许叶），海南医学院第一附 属医院神经内科一病区（王琰）通信作 者：王琰，：脑与神经疾病杂志年第卷第期，；，（？），（），（），；帕金森病（，）是一类 在中老年患者中较为 多见的神经方面的退行性疾病，也是全球第二大神经退行性疾病。炎症小体作为蛋白、以及凋亡相关的微粒蛋白（）共同组成的多蛋白复合体，在相当多的种疾病和免疫反应的病理标本中都可以检测 到炎性小体的表达。有研究证明使用抑制剂能够缓解的动物模型多巴胺相关神经元的损伤。因此对于的炎性小体和其蛋白通路的调控研究对发生机制与治疗提供了新的方向。因此，本
4、课题用伊拉地平对诱导的小胶质细胞进行干预，通过检测伊拉地平干预前后是否影响小胶质细胞中，（蛋白水平，探索伊拉地平的保护神经的作用以及其保护效果是否和缓解炎症的损伤有关，从而为防治的提供相关的研究方向。本研究旨在探讨伊拉地平对炎症通路中的作用并阐 明其分子机制，以期为的治疗提供新的思路。材料与方法？主要试剂、细胞株及仪器的小鼠小胶质细胞（购自武汉普诺赛公司）；培养基（赛默飞美国）；兔抗鼠（赛默飞美国）；鼠抗鼠单克隆抗体（赛默飞美国）；鼠抗兔单克隆抗体（赛默飞美国）鼠抗兔单克隆抗体和蛋白浓度的测定试剂盒（赛默飞美国）；鼠抗兔单克隆抗体（江苏亲科生物研究中心有限公司）。提取的试剂盒和荧光定量预混液（
5、购自上海普洛麦格生物产品公司）、检测的试剂盒（上海东仁化学公司）；逆转录预混液（上海翌圣生物科技有限公司，中 国）；多功能酶标仪（天津泰斯特仪器有限公司）；实时荧光定量仪（，美国）。？细胞培养、分组复苏细胞，细胞放于恒温细胞培养箱内。使用链霉素，青霉素混合双抗和胎牛血清混合培养基提供所需液体生长环境。细胞放于恒温细胞培养箱内。具体分组如下：空白对照组，造模组，伊拉地平预处理组，组。法检测细胞增殖能力取合适生长密度的小胶质细胞作为实验用细胞，用移液枪小心吸取细胞上的培养基，再用磷酸盐溶液进行清洗。在清洗后的细胞内加胰蛋白使其覆盖细胞表面充分消化细胞，在消化后加人培养基稀释胰蛋白酶并将混合溶液进行
6、离心。将离心好的细胞吸出上清液并再次加人完全培养基混勻成细胞悬液。使用细胞计数仪检测细胞浓度，并根据检测结果调整浓度。将细胞悬液快速接种到孔板内。将接种好的孔板放于细胞培养箱中培养。将药物加人到孔板的细胞内。把 实验试剂加人到孔板的细胞内，再次放人细胞培养箱内等待试剂反应。按实验操作要求放入多功能酶标仪内检测细胞光吸收值。根据实验数据结果计算细胞存活情况，并分析细胞存活结果。实时荧光定量（）法检测炎症因子表达提取细胞（在无菌和无酶的条件下进行此项实验），取出药物处理好的细胞，用移液枪或一次性吸管吸取适量并缓慢冲洗细胞表面。使用胰蛋白酶缓慢消化六孔板细胞，加入培养基稀释胰酶，将细胞悬液放离心机中
7、收集细胞，加入细胞裂解液并重悬细胞。将充分裂解的细胞转移到新的离心管中，使用震荡机进行充分混合摇匀。将细胞悬液放入离心机并进行离心。待离心结束后使用移液枪将上层液体转移到新的离心管内，加人丙醇，并使用震荡机进行充分震荡摇勻。对液体进行低温高速离心。移液枪吸取上层液体，保留下层白色沉淀，并加入无水乙醇，使用震荡机进行充分震荡摇勻。再次对所得液体进行低温高速离心。用移液枪吸取上层液体。在离心管内加人超纯水来溶解所得。将所得样本放于液氮罐内保存。浓度和纯度测定，使用多功能酶标仪检测脑与神经疾病杂志年第卷第期所得浓度和质量，待仪器自动检测完成后，加人超纯水来是酶标仪归零，及时检测并记录样本在处的光吸收
8、值和样本浓度。逆转录，在 每个实验管内小心加人提取的样本。按照实验试剂盒说明书加人多 聚胸 腺嘧啶，重复寡 核苷酸试剂。用补足至。提前在仪器上设置好逆转录 时间与温度，待程序完成后，将样本放于低温环境下保存。按说明书依次加配置好的引物试剂，脱氧核苷三磷酸试剂，逆转录实验缓冲液，酶抑制 剂，反转录酶试剂，焦炭酸二乙酯无菌超纯水，用移液枪抽吸混勻。然后设定好仪器程序。将得到的快速放人液氮中保存。实验所需引物方案，如表所示。表引物序列引物正向序列反向序列，（，（，（，（，荧光定量实验过程，根据实验说明书在聚合酶链式反应实验管中加入以下试剂两倍的实时荧光定量聚合酶链式反应混合液，实验前已稀释好的实验引
9、物，逆转录实验样本和试剂盒内的耐热聚合酶。设定好实时荧光定量仪上的扩增程序，先提高样本温度到并维持。后进行，：，；，的变性循环，共进行次循环。之后将温度以升温的效率将温度提高到，等待实验结果。实验结果分析，应用法对实验结果进行处理分析。法检测 细胞、蛋白的表达制备实验所需样品，待实验样品药物处理完成后。使用磷酸盐溶液对种植与六孔板上的细胞表面进行清洗。清洗完成后，加入蛋白酶抑制剂和细胞裂解液的混合溶液。当六孔板表面的细胞被混合液充分裂解完成后，将得到实验样本进行高温低速离心，并将离心后产物放入液氮罐中保存；法测定样本浓度，按照试剂盒说明书配置检测溶液，摇勻后备用。在孔板内加人之前制备好的蛋白样
10、本并使用磷酸盐溶液进行溶解，同样也要设置三个复孔浓度。在每个孔中加入提前配置好的检测溶液，并在室温条件下放置一段时间。使用多功能酶标仪检测各个样本的光吸收值，并绘制实验曲线，计算实验数据，分析实验结果；蛋白变性处理：在蛋白样本中加入六倍的聚丙酰胺凝胶电泳缓冲液并充分震荡摇勻，再将样本放人沸水中加热，以使样本变性；加样，先配置好电泳和转模缓冲液及。使用移液枪安提前设置好的实验方案加人蛋白样品，并选用合适的标记蛋白样品加入到凝胶上；蛋白电泳：根据蛋白条件选择合适的电压和时间来跑分离胶和浓缩胶；电泳转膜，提根据凝胶大小裁剪膜并放入提前准备好的甲醇溶液中完全浸泡一段时间，再将浸泡好的膜放人转膜液中浸泡
11、。按照转膜所需顺序将膜、海绵垫、凝胶、滤纸、缓慢有序放人转膜夹层内。设置好转膜电流和转膜时间；蛋白封闭：提前配置好含有牛血清蛋白或者脱脂奶粉的蛋白封闭液。待电泳转膜结束后，根据标记蛋白所处的位置小心裁剪电泳条带。使用缓冲液进行清洗并裁剪出目的条带；一抗孵育：把实验所需的一抗抗体中加入缓冲液进行一定程度稀释。将蛋白样本条带放入到调配好的一抗稀释液内，放于摇床上摇匀；二抗孵育：将浸泡过夜的蛋白条带放入缓冲液进行多洗小心清洗。在缓冲液中加入脱脂奶粉和二抗稀释液，将蛋白样本条带放人调配好的二抗稀释液内，在室温下缓慢摇匀；显影，在实验专用暗室中将液和 液进行等比例混合，把得到的位于膜上的样本蛋白放入两层
12、透明薄膜之间，使溶液完全浸没样本，充分反应，大约在加入试剂后，加入显影和定影试剂来对样本进行显影和定影操作，根据成片结果来调整曝光条件，以达到最合适效果。细胞免疫荧光在六孔板内放入细胞爬片并种入细胞。待六孔板上细胞生长到所需密度时加人实验药物干预。干预完成后用移液枪小心吸干药物和培养基。小心加入多聚甲醛使其覆盖六孔板。待固定完成后加入脑与神经疾病杂志年第卷第期磷酸盐溶液进行多次冲洗。使用配置好的封闭液对细胞爬片进行封闭处理固定时间。将稀释好的抗体小心加人到细胞爬片上。使用磷酸盐溶液对细胞爬片进行多次清洗。将二抗稀释到封闭液中并加人覆盖细胞爬片。对细胞爬片进行细胞核染色，完成后进行封片处理。使用
13、荧光显微镜对爬片拍照。选取视野进行细胞计数。？统计学方法使用 和软件分析实时突光定量聚合酶链式反应数据。使用和软件对和免疫荧光实验结果进行分析。实验所得结果为实验多次重复数据，重复实验数据最少为三次，实验所得计量资料数据使用均数士标准差说明。结果对小胶质细胞生物活性的影响在使用？、？、（？（？的药物对小胶 质细胞 进行干预后，使用实验法对小胶质细胞的活性进行检测，与对照组（）相比，其结果分别为（、）。可以观察到在上述种浓度的作用下，小胶质细胞的活性都有所下降，而且在将药物组与组相对比后，细胞活性差异有统计学意义（）。考虑到使用对小胶质细胞进行细胞炎症模型造模的需求，选择使用？的溶液浓度作为药物
14、干预浓度。伊拉地平对诱导的小胶质细胞的保护作用使用不同浓度的伊拉地平（？、？、；卜、：）处理的￥小胶质细胞存活率，与对照组（）相比，其结果分别为（、）。随着伊拉地平浓度的增高开始降低细胞的存活率。因此，考虑伊拉地平对细胞活性的影响程度和相关文献结果，使用？的伊拉地平作为干预药物浓度。对小胶质细胞的形态的影响图左为小胶质细胞在光镜下的静息状态，而在处理后为右图结果，细胞被激活。图对小胶质细胞的形态的影响图为 细胞免疫荧光结果，实验发现荧光染色在小胶质细胞上有表达，证明该细胞为小胶质细胞伊拉地平对诱导的小胶质细胞炎症模型（、基因表达水平（表）表伊拉地平对诱导的小胶质细胞炎症模型、基因表达水平的影响
15、）组别组 组 伊拉地平组 组 注：与对照组比较：；与组比较，（）；下表同如表所示，使用实时荧光定量（）的表达水平。可以看到，在造模组中的检测空白对照组、造模组、伊拉地组和、和的表达组中、水平均有所提高，在伊拉地平预处理组中（、脑与神经疾病杂志年第卷第期、和的表达水平有所下 降，预处理组的、也呈下降趋势，但表达水平却无明显变化。的表达水平在四个实验组中并无特异性改变。伊拉地平对诱导的小胶质细胞炎症模型、蛋白表达水平的影响（图）国圔團图伊拉地平处理后对、蛋白免疫荧光结果（）画矚画國画國图 伊拉地平处理后对、蛋白表达结果表伊拉地平处理后对、蛋白表达水平的影响（，）组别组 组 伊拉地平组土组 如图，和
16、表所示，在造模组中的、的蛋白表达含量有着显著提高，说明在诱导的小胶质细胞炎症模型中炎症通路中的蛋白被有效激活。在伊拉地平预处理组和 预处理组中、蛋白水平表达含量均由不同程度的下降，也就是说在伊 拉地平预处理组和 预处理组中的炎症通路在一定程度上被抑制，降低了小胶质细胞的炎性因子表达情况。实验结果说明伊拉地平抑 制了小胶质细胞通路炎性因子的激活和释放。讨论作为一类临床常见和神经退行相关的疾病，会导致以运动迟缓、静止性震颤、姿势步态障碍和肌强直为主的运动功 能 障碍。研究显示多种因素如遗传，细胞炎症，氧化应激，线粒体的功能出现障碍均可参与的发病过程。但各因素具体机制以及相关联系并未完全清楚。近年来研究发现，神经的炎症在的发病过程中发挥了极为重要的作用，的神经炎症反应与炎症通路的表达有关。在的神经组织病理检测与观察中发现存在慢性的神经炎症反应，慢性的神经反应在的发病与病情发展中均可以被检测到，但在中，慢性炎症反应在神经组织病变中充当 了怎样的 角色，是如何发挥作用和发挥怎样的作用，这里面的相关作用机制仍在探索的阶段。在的主要表现的神经元细胞损伤中，遗传作用，慢性神经炎症和细胞老化均为致病因素
