1、 基金项目山东省自然科学基金项目（编号：）；山东省中医药科技发展计划项目（编号：）作者简介时海燕，女，博士，主任药师，研究方向：中药药效物质与药动学基于 技术分析鉴定中药三棱入血成分时海燕，徐男，王平，吴迪，郑伟，（山东第一医科大学第一附属医院山东省千佛山医院临床药学，山东省儿童药物临床评价与研发工程技术究中心，山东省医药卫生临床药学重点实验室，山东 济南 ；山东省中医药研究院中药制剂研究所，山东 济南 ；山东中医药大学药学院，山东 济南 ）摘要目的：利用超高效液相色谱四极杆静电场轨道阱高分辨质谱法（）分析三棱提取物在大鼠体内的入血成分。方法：采用 色谱柱（，），以 甲酸乙腈溶液（）甲酸水溶液
2、（）为流动相进行梯度洗脱，流速 ，进样量。质谱分析采用电喷雾离子源，在正、负离子模式下采集数据，扫描范围 。采用 软件获取特征碎片离子信息，结合数据库（，、数据库及文献确定入血成分。结果：综合质谱检测信息，从三棱药材提取物中解析出 个化学成分，大鼠口服给药后，含药血浆中分析出 个成分，包括 种原型成分和 个代谢产物，其主要代谢途径分别为甲基化、去甲基化、还原反应、葡萄糖醛酸化等。结论：本文采用 技术分析鉴定了三棱主要入血成分及部分代谢产物，为阐明三棱的药效物质基础和质量控制奠定基础。关键词 ；三棱；入血成分 中图分类号 文献标识码 文章编号 （）：，（，；，；，）：（，）（）（）（），：；三
3、棱 为 黑 三 棱 科 植 物 黑 三 棱 的干燥块茎，味辛、苦，性平，归肝、脾经，具有破血行气、消积止痛的功效，用于癥瘕痞块、瘀血经闭、食积胀痛，胸痹心痛。研究表明，三棱中主要含挥发油类、苯丙素类、黄酮类等化学成分。项目组前期研究发现，三棱含药血清具 有 内 皮细胞 保 护 作用，可以降低脂多糖（，）诱导的细胞氧化损伤和炎症，降低凝血级联反应，但其保护内皮细胞的药效物质尚未阐明。分析三棱的入血成分，有助于研究三棱发挥作用的药效物质基础。中药药效物质的鉴定包括已知化合物的确认和未 知 结 构的 阐 明。高中国医院药学杂志 年月第 卷第期 ，分 辨 质 谱（，）通过精确质量数、特征性质谱裂解碎片
4、，结合文献或标准品的数据以及化合物的生物来源等快速有效地推断、鉴定中药中的化学成分。因此，高分辨率质谱高灵敏度、检测动态范围宽范的特点，为中药体内外成分表征提供强有力的支撑。本文利用超高效液相色谱四极杆静电场轨道阱高分辨质谱法（）分析鉴定三棱的化学成分及大鼠给药后的入血成分，为三棱的药效物质基础、新药研发及临床应用研究等提供相关数据参考。材料 仪器超高效液相色谱联用 型四极杆静电场轨道阱高分辨质谱仪（美国 公司）；型高速离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司）；型旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；型真空干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）；型十万分之一电子天平（瑞士梅特勒托利多仪器有限公司）。试药
5、三棱，为黑三棱科植物黑三棱 的干燥块茎，产自山东，药材经山东省中医药研究院靳光乾研究员鉴定，符合 中国药典 年版规定。甲酸和乙腈为质谱级（美国 公司），纯净水（广州屈臣氏食品饮料有限公司）。动物 级健康 大鼠 只，周龄，体质量 ，由济南市朋悦实验动物繁育有限公司提供，许可证号 （鲁）。饲养于山东省中医药研究院动物房，饲养室温度（），相对湿度 ，光照周期为 明亮和 黑暗。本研究所涉及的动物实验经山东省中医药研究院实验动物伦理委员会批准（批准编号：）。方法 三棱提取物的制备精密称取三棱药材 ，粉碎，过号筛，置 圆底烧瓶中，加入 甲醇 ，加热回流提取次，每次 ，放凉、过滤，旋蒸后水浴蒸干，加水复溶，
6、定容至 容量瓶，即得三棱提取物。给药和样本采集 含药血浆样本的采集取只 大鼠作为给药组，每只大鼠用“”项下三棱提取物灌胃，给药剂量 （按正常成年人 计算相当于临床等效剂量的 倍，以生药量计）；早晚各次，连续灌胃 ，末次给药后禁食不禁水 ，第天灌胃后分别在，在大鼠眼内眦静脉丛取血 ，各时间点血浆样品等体积混匀后，放置于 抗凝管中，离心 （离心半径 ），取上清液，即得含药血浆样本。空白血浆样本的采集取只 大鼠为空白组，每只大鼠灌胃相同剂量的生理盐水，灌胃 后在大鼠眼内眦静脉丛取血 ，放置于 抗凝管中，离心 （离心半径 ），取上清液，既得空白血浆样本。血 浆 样 本 的 处 理 与 分 析取“”和“
7、”项下血浆样本 ，分别置于离心管中，加倍量乙腈沉淀蛋白，涡旋振荡 ，离心 ，取上清液 ，进行 分析。色谱及质谱条件 色谱柱（，），流动相为 甲酸乙腈溶液（）甲酸水溶液（），梯度洗脱（，；，；，；，；，；，；，；，；，），流速 ，进样量，柱温 。采用加热电喷雾离子源（），检测模式为正、负离子 ，分辨率 ，鞘气流速设定 ，辅助气流量 ，裂解电压 ，离子传输管温度 ，辅助气温度 ，扫描方式采用全扫描数据依赖二级扫描（），质谱扫描范围 ，碰撞能梯度为，。统计学处理采用 软件进行 文件特征峰提取，并采用 ，和 数据库同时进行特征峰鉴定，筛选标准为最佳匹配得分 分，对筛选后目标化合物的质谱信息与相关文献对
8、比，进行化合物分析鉴定。结果 分 析 结 果采 用 技术，对三棱提取物、空白血浆和含药血浆对应的色谱图，根据 软件辅助分析化合物的质谱裂解规律，结合保留时间和相关文献，鉴定出药材中 个成分。大鼠口服给药后，检出大鼠血浆中 个入血成分，其中，个为药材中的原形成分，个可能为代谢产物。见图。中国医院药学杂志 年月第 卷第期 ，图正（）、负（）离子模式下三棱的质谱总离子流图 （）（）药 材 成 分 鉴 定本 研 究 通 过 使 用 技术 分 析 鉴 定 了 三 棱 药 材 中 的 个成分，包括 个黄酮 类化 合物、个 有 机酸类化合物、个苯丙素类化合物、个萜类化合物、个醛 类 化 合 物、个 氨 基
9、酸 类 化 合 物、个糖类化合物、个生物碱类化合物以及个蒽醌类化合物，见表。黄酮类化合物黄酮类化合物为原型成分中数目最多的化合物，本研究鉴定出原型成分为黄酮类的化合物共 个。黄酮类化合物主要指以苯基色原酮为母核的一系列化合物，一般是以 为基本骨架且具有广泛生物活性的一类天然次级代谢产物。黄酮类化合物中 环相比 和 环更加稳定，所以大多数裂解发生在 环和 环，一般裂解容易丢失（）、（）、（）、（）和（）离子碎片形成碎片离子。特殊裂解则在多级质谱中，在质谱条件下，黄酮化合物主要以高能碰撞失去糖基变成丰度较高的黄酮苷元，黄酮苷元在、环上常有羟基、甲基、甲氧基、异戊烯基等取代基，黄酮苷元的裂解以 环为
10、中心产生逆狄尔斯阿尔德反应（，反应），该反应以不同的方式丢失和重排，得到子离子 和。裂解主要是环上和键的断裂，形成碎片离子，这些碎片离子被用作黄酮类化合物的诊断离子，用来确定苷元的类型以及和环上的取代基类型。中国医院药学杂志 年月第 卷第期 ，表三棱药材成分鉴定 编号 相对分子质量分子式化合物名称质荷比（）模式主要二级碎片离子质荷比（）类型 文献 三七素 ，苏氨酸 ，甜菜碱 ，右旋奎宁酸 ，脯氨酸 ，盐酸胡芦巴碱 ，水苏碱 ，羟甲基糠醛 ，棉籽糖 ，蔗糖 ，柠檬酸 ，乳糖 ，莽草酸 ，缬氨酸 ，耐斯糖 对羟基肉桂酸 ，酪氨酸 ，香豆素 ，龙胆酸 色氨酸 ，原儿茶醛 ，水杨酸 西伯利亚远志糖 ，
11、紫苏葶 ，原儿茶酸 ，咖啡酸 ，对羟基安息香醛 ，甲氧基水杨醛 ，香兰素 ，芦丁 ，丁香醛 ，芥子酸 ，阿魏酸 ，水仙苷 ，异鼠李素 ，射干苷 ，柚皮苷 ，橙皮苷 ，新橙皮苷 ，壬二酸 香 叶 木 素葡萄糖苷 ，金合欢素 ，黄豆黄苷 ，二 羟 基 苯 甲 酸乙酯 ，异橙皮内酯 ，芦荟大黄素 鹰嘴豆芽素 ，异甘草素 ，木犀草素 山柰酚 ，黄芩素 ，羟基芫花素 ，射干苷元 ，甲氧基香豆素 ，大豆苷元 ，柚皮苷查尔酮 ，毛蕊异黄酮 ，中国医院药学杂志 年月第 卷第期 ，续表编号 相对分子质量分子式化合物名称质荷比（）模式主要二级碎片离子质荷比（）类型 文献 大黄素甲醚 ，橙皮素 ，黄豆黄素 ，异阿魏
12、酸 ，藁本内酯 ，甘草酸二铵 ，羟基黄酮 ，川陈皮素 ，桔皮素 ，白术内酯 ，亚麻酸 ，白术内酯 亚麻酸乙酯 ，注（）：氨基酸类（），糖类（），黄酮类（），生物碱类（），蒽醌类（），有机酸类（），苯丙素类（），醛类（），萜类（），代表入血成分（）。根据二级质谱解析，化合物 在 模式下的准分子离子峰为 ，根据元素分析结果可知其分子式为 ，母离子丢失了一分子葡萄糖和一分子鼠李糖个糖基得到特征分子为 ；为 丢失了一 个 原 子 得 到；为苷元发生 裂解，产生，环质子。通过文献研究和质谱裂解规律对比，可知该化合物为芦丁。有机酸类化合物有机酸类化合物是数目排在第二位的化合物，本研究鉴定出原形成分为有机酸
13、类的化合物共 个，包括亚麻酸、壬二酸、芥子酸等。有机酸类化合物主要指一些含有酚羟基、羧基、亚磺酸等取代基的具有酸性的有机化合物。根据二级质谱解析，化合物 在 模式下的准分子离子峰为 ，根据元素分析结果可知其分子式为 ，得到特征分 子 为 ，或，或。通过文献研究和质谱裂解规律对比，可知该化合物为芥子酸。苯丙素类化合物本研究鉴定出原型成分为苯丙素类的化合物共个。通过文献对比以及质谱解析可知，包括阿魏酸、异阿魏酸、甲氧基香豆素、咖啡酸等，其中大多数为香豆素类，简单香豆素类成分的裂解方式主要为失去 或 或，当其母核有羟基取代时，和 可分别交替丢失。根据二级质谱解析，化合物 在 模式下的准分子离子峰为
14、，根据元素分析结果可知其分子式为 ，二级质谱信息得出特征分子为 、。根据文献研究以及和对照品行为比较，可知该化合物为阿魏酸。氨基酸类化合物鉴定出原型成分为氨基酸类的化合物共个，通过文献对比以及质谱解析可知，包括苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸和脯氨酸。根据二级质谱解析，化合物 在 模式下的准分子离子峰为 ，根据元素分析结果可知其分子式为，二级质谱得出特征分子为 、。综合信息以及文献研究和质谱裂解规律比较，可知该化合物为缬氨酸。萜类化合物鉴定出原型成分为萜类的化合物共个。通过文献对比以及质谱解析可知，包括藁本内酯、甘草酸二铵、白术内酯、白术内酯、亚麻酸乙酯、紫苏葶。化合物 为苯酞单体类化合物，此类
15、化合物在质谱裂解中容易丢失、烷基自由基（、等）及 等产生特征碎片。根据二级质谱解析，化合物 在 模式下的准分子离子峰为 ，根据元素分析结果可知其分子式为 ，二级质谱信息得出特征分子为 ，。综合信息以及文献研究和质谱裂解规中国医院药学杂志 年月第 卷第期 ，律比较，可知该化合物为藁本内酯。入血成分鉴定本研究通过使用 技术分析鉴定大鼠灌胃三棱供试液后血浆中含有 个药材中的原型成分及 个代谢产物。代谢途径主要分为相代谢（去甲基化 反应、氧化和还原反应），相代谢（葡萄糖醛酸化反应 ）等。大鼠灌胃三棱前空白血浆中的化学成分总离子流图（，）见图，大鼠灌胃三棱后血浆中的 见图。为可能的原型成分，为可能的代谢
16、产物，结果见表。本研究主要的代谢产物为黄酮类化合物，因此以黄芩素和金合欢素的代谢途径为例，对代谢途径进行解析。在 模式下检测到化合物命名为 ，其保留时间为 ，相对分子质量为 ，形成准分 子 离子 ，推测其分 子 式 为 。通过二级质谱解析，产生主要的特征离子为 ，符合黄芩素裂解规律，但与黄芩素相比，准分子离子比黄芩素多了 ，因此确定 是黄芩素的甲基葡萄醛酸化代谢物。图负离子模式（）和正离子模式（）下空白血浆样品的质谱图 （）（）中国医院药学杂志 年月第 卷第期 ，图正（）、负（）离子模式下大鼠三棱提取物灌胃后血浆中的化学成分的总离子流图 （）（）在 模式下检测化合物命名为，其保留时间为 ，相对分子质量为 ，形成准分子离子 ，推测其分子式为 。通过二级质谱解析，产生主要的特征离子为 ，符合黄芩素裂解规律，但与黄芩素相比，准分子离子比黄芩素多了 ，因此确定 是黄芩素的葡萄醛酸化代谢物。黄芩素可能的代谢途径如图。在 模式下检测到化合物命名为 ，其中保留时间为 ，相对分子质量为 ，形成准分子离子 ，推测其分子式为 。通过二级质谱解析，产生主要的特征离子为 ，符合金合欢素裂解规律，但与金合欢素相
