1、第 卷 第 期 年 月电 子 显 微 学 报 ，文章编号：（）基于单细胞荧光成像技术的昼夜节律监测分析李 森，许钰铃，王佳荣，李佩瑶，何春雨，于希平，李慧艳，张宇程，胡怀斌，宋增庆，王 凯，韩秋影，涂海情（国家生物医学分析中心，北京）摘 要 昼夜节律作为机体的无形时钟精密调控多种生理功能，包括睡眠、觉醒、大脑认知、免疫力等。下丘脑视交叉神经上核（，）作为昼夜节律系统的主起搏器，能够自主产生节律性输出信号，协调维持全身多个组织、器官的时钟变化。同时，通过神经元间的耦合作用，实现不同神经细胞节律性变化的步调一致性，产生强劲的振荡性规律，以维持机体内部节律稳定、抵抗外界环境因素干扰。为直观的研究 区
2、在机体昼夜节律中的功能，实现单细胞尺度观测 神经元节律性变化，本研究搭建了单细胞荧光成像系统，通过深度制冷 相机，利用荧光素酶报告基因系统，对体外分离培养的 脑片进行长周期实时成像，原位观察 区不同细胞节律基因的振荡性表达规律。利用、等软件，对荧光强度在单细胞尺度及时间尺度上进行量化分析，最终实现了在单细胞水平监测观察节律基因的振荡性变化。利用河豚毒素（）能够可逆性的破坏 细胞间的耦合作用，验证了该系统的可行性。综上，本研究成功搭建了基于荧光素酶报告基因系统的单细胞实时荧光成像平台及分析技术，实现了对 神经元基因表达节律性变化的实时监测。关键词 昼夜节律；荧光素酶；实时成像中图分类号：；文献标
3、识码：收稿日期：；修订日期：基金项目：国家自然科学基金资助项目（）作者简介：李森（），男（汉族），山东人，博士研究生：通讯作者：涂海情（），男（汉族），湖北人，副研究员：昼夜节律又称“生物钟”，是生物体为了适应外界环境而产生的一套内在的时间控制系统。下丘脑视交叉神经上核（，）作为哺乳动物昼夜节律的调控中枢，能够接受和整合外界光信号，并通过自主神经递质和糖皮质激素通路调控不同外周组织的子时钟，形成完整的昼夜节律系统，进而调控多种重要的生理功能。是一个包含约 个神经元的异质群体，其中的单个细胞在放电频率和基因表达上都呈现独立自主的昼夜节律性振荡，形成独立的细胞振荡器。和所有其他组织细胞的昼夜节律都
4、是基于核心节律基因的转录翻译反馈环路（，）：和 激活 和 的转录，累积的 和 蛋白又会抑制 对自身的转录，使得 和 的表达呈现明显节律性变化。与此同时，神经元之间能够进行通讯耦合，形成完整的 神经元网络，使所有的细胞振荡器产生一致且具有鲁棒性的节律性输出信号，精密调控外周时钟，抵抗外界环境因素的干扰，维持内部昼夜节律系统的稳定。神经元之间能进行通讯耦合也是其作为昼夜节律调控中枢、区别于外周时钟的特性。对 振荡器进行长期、实时的单细胞荧光成像监测，能够直观地研究 不同细胞的节律基因振荡特性，进一步加深对昼夜节律系统的理解和认知。荧光素酶（）是自然界中天然存在的一种蛋白酶，可以催化荧光素底物，发出
5、特定波长的荧光（）。荧光素酶的自发荧光具有以下特性：首先，它不需要外界的激发光源，检测信号来源于组织的自发荧光，因此不存在光毒性的问题；其次，大部分荧光素酶的半衰期很短，只有几个小时甚至有些只有一个小时左右，使得荧光素酶能很好的指示昼夜节律基因的周期性表达变化；此外，生物组织的荧光素酶自发光背景信号很低，具有较高的信噪比。因此，尽管荧光素酶催化发光很弱，但很适合作为一个光学报告工具来监测不同细胞昼夜节律变化过程。荧光素酶基因经改造整合到多个物种的基因组中，在不同节律基因启动子的控制下来指示昼夜 第 期李 森等：基于单细胞荧光成像技术的昼夜节律监测分析 节律的变化过程，已成功应用在聚球藻、拟南芥
6、、果 蝇和 啮 齿 动 物中。：小鼠（）是已成熟应用荧光素酶系统来指示昼夜节律变化的报告基因小鼠。该小鼠是将 基因融合表 达 在 节 律 基 因（）的 末端，因此可通过荧光素酶的自发荧光来指示 的表达变化。小鼠的 和外周组织都表现出强劲的生物发光昼夜节律，对生物节律在遗传和生化上的机制研究有着广泛的应用。本文将介绍一种实时观测小鼠 区不同细胞节律基因振荡变化的技术方法：利用荧光素酶报告基因系统，采用深度制冷 相机在单细胞水平对 脑片进行长时间的实时成像；进一步对单细胞荧光信号强度进行时间序列的统计量化，分析 区不同神经元之间的通讯耦合特性。材料与方法 实验试剂、材料、仪器 小鼠（），培养基（）
7、，（），葡萄糖（），青霉素链霉素双抗（），（），碳酸氢钠（），缓冲液（），甲虫荧光素（，），河 豚 毒 素（，），细胞培养皿（康宁），、插入式细胞培养皿（），圆形盖玻片（北京螽斯羽），振动切片机（徕卡），通 道 生 物 节 律 光 度 测 定 仪（），深度制冷 相机（，），倒置显微镜（）。分离培养 脑片 小鼠麻醉后迅速取出大脑组织，置于预冷的完全 缓冲液（表）中。利用振荡切片机沿大脑冠状面切出厚度 的完整脑片（振幅：，切片速度：），随后通过体式显微镜用手术刀在下丘脑视交叉上核部位切出 的 组织切片（图），并将其放入 插入式细胞培养皿上方，在底部添加 脑片完全培养基（表）和 荧光素底物，用圆形盖
8、玻片进行树脂密封（图）。通道生物节律光度测定仪（）置于 培养箱中，以维持恒温避光环境（图）。将上述培养体系放于 中，持续监测 个周期的振荡信号，以确保脑片存活和振荡活力，在信号振荡高峰时将脑片拿出进行荧光成像采集。处理脑片时，将 溶于 新鲜培养基中对培养脑片进行换液；在洗掉 时，用新鲜培养基对培养脑片进行换液，重复至少三次。表 完全 缓冲液（配制 体积）（）成分体积 表 脑片完全培养基（配制 体积）（）成分用量 单细胞荧光成像 成像显微镜选择 倒置显微镜，搭载 物镜（）。显微镜外接 深度制冷 相机，相机制冷温度设置为，以降低相机暗电流噪声，显微镜培养室设置恒温 。将 脑片培养皿放于培养室，采用
9、明场聚焦后关闭一切外界光源。相机设置 分辨率，曝光时间设置为 ，连续拍摄 天，采集时间序列图像。因生物荧光素发光很弱，确保拍摄环境完全避光以降低背景噪声。图像处理将拍摄图像按时间序列导入图像分析软件 （）存以 文件，用 功能中的中值滤波器（）对图像进行去噪声处理，以排除相机传感器暗电流、外界光源泄露以及宇宙射线等噪声因素。荧光信号强度的量化分析 数据导出 在 图像中以 大小随机圈出 个单细胞的统计区域（，），并将 的荧光强度值以时间序列导出至。去趋势（）去趋势目的是去除信号变化的基线，以揭示信号值的振荡结构。由于在长时间培养过程中培养基成分变化、荧光素底物的消耗以及切片对培养体 电子显微学报
10、第 卷系的适应等因素，原始的信号值除具有昼夜节律性振荡变化外还含有一个时间尺度的趋势。采用（）滤波器对 数值进行去趋势化处理，相对于多项式法它优势在于根据振荡分量进行拟合，因此不会过度拟合基线趋势：（）（）（）。：初始值，：平滑趋势的时间序列值，：图像采集频率。图 脑片体外分离培养体系。区在大脑冠状面的模式图；脑片体外分离；脑片在插入式培养皿中体外培养，上覆圆形玻片并用树脂胶密封；通道生物节律光度测定仪；生物节律 光度测定仪检测 脑片荧光信号。；，；（）；：将原始数据值导入时间序列分析软件 （），采用内置 滤波器对 原 始 时 间 序 列 去 趋 势 处 理，值 设 置为 。平滑处理（）为进一
11、步去除时间序列的振荡噪声，更好的进行 标 准 函 数 拟 合，将 数 据 导 入（），采用相邻两小时数据平均法进行平滑处理。数据拟合（）将平滑处理的时间序列数据在 中拟合为标准衰减正弦函数，以计算振荡的相位角、振幅、周期和指数衰减率：（）（）。：荧光强度，：时间，：时振幅，：振幅指数衰减的时间常数，：周期，：相位。相位分析 由于不同细胞荧光强度之间存在差异，在比较 值之间相位差异时要将不同量级的数据转化为同一量度，以保证数据之间的可比性，本文采用 标准化处理方法：。：观测值，：样本均值，：样本标准差。将 标 准 化 数 据 导 入 在 线 网 站（：），应用 方法计算每一个 时间序列在一个周期
12、内的相位值。将相位数据导入软件 （，），分析不同细胞 振荡相位的一致性。实验结果 细胞的自发荧光呈现昼夜节律性变化 为观察荧光素酶发光系统指示昼夜节律基因的表达变化，如图 所示，体外分离培养 脑片，先将培养脑片放于生物节律光度测定仪中（图），利用其内置的光电倍增管，将荧光信号转化为电信号进行脑片整体的荧光信号采集，以判断脑片活率和信号活力，数据显示 脑片整体的荧 第 期李 森等：基于单细胞荧光成像技术的昼夜节律监测分析 光信号具有强劲的振荡变化，振荡周期约为 天（图）。在信号振荡达到高峰时，利用深度制冷 相机对 小鼠 脑片进行持续 天的、实时荧光信号采集。结果显示 细胞能够自发荧光，任意选取一
13、个细胞观察发现其发光强度随时间呈以约 小时为周期的振荡性变化（图，补充数据 见网络版）。在整体水平观察发现，大多数细胞荧光信号的强弱变化相一致（图）。图 细胞随时间变化的荧光图像。大图为 整体荧光强度变化，插图为单个细胞的荧光强度变化；为荧光信号最弱的时间点。大图 ；小图 ；区单细胞荧光信号变化的周期统计，每个点代表一个脑片 中 个单细胞荧光信号振荡的周期平均值。；为客观显示荧光信号的振荡特性，对单个细胞 荧光强度进行数值量化，如图 所示，去趋势处理可将内含的基线趋势去除掉（图，）；平滑处理可进一步去除振荡噪声（图）；由于荧光素底物的消耗，以及脑片代谢废物的累积导致的活力下降等因素影响，荧光信
14、号的振幅随记录时间延长呈现了逐渐缩小的趋势，因此最后通过一个标准的衰减正弦函数对时间序列进行拟合（图），结果显示 单个细胞的荧光强度值随时间呈周期性振荡变化（图）。图 单细胞荧光强度量化分析。绿色线为 滤波器拟合原始信号值（黑色线）的基线趋势；去除基线趋势的信号 值；将去趋势的信号值进行平滑处理；将信号值进行衰减正弦函数拟合；，图量化比较。；，图 破坏 细胞间的耦合作用。处理前，处理中和洗后三个阶段单细胞荧光信号变化轨迹，每条线代表一个细胞（）；上：单细胞荧光信号变化的热图展示，下：单细胞荧光信号振荡变化的时相分布；处理前，处理中 和洗后三个阶段 荧光信号时相变化统计分析（）。：，；：；：；电
15、子显微学报 第 卷 细胞的昼夜节律具有通讯耦合特性 细胞间通讯耦合特性使得每个细胞振荡器产生一致且具有鲁棒性的振荡变化，因此 整体的荧光信号具有强劲一致的节律性振荡。河豚毒素（）是一种 通道的阻断剂，能够抑制动作电位的产生从而阻断细胞之间的通讯。为了观察 细胞间的通讯特性，使用 处理 脑片，统计 个细胞的荧光信号变化规律，结果显示，在 处理之前，的 荧光信号呈强劲一致的节律性振荡；在 处理的 天时间内，荧光信号的振幅明显减弱（图），通过标准化热图和瑞利分布图分析显示，不同 荧光信号振荡的时相变得不一致，表明 破坏了细胞间的通讯；将 彻底洗掉后继续观察，发现 细胞的荧光信号振荡时相恢复了一致性，
16、且振幅也增强至 处理前的水平（图，）。图 是对不同 脑片中细胞的振荡时相一致性的统计分析，结果表明，处理增加了 细胞振荡时相的紊乱程度，将 洗掉后时相的一致性得以恢复。综上，利用荧光素酶报告基因系统，通过单细胞实时成像的方法，直观地观察到 细胞节律基因表达具有强劲的周期性振荡变化，且不同细胞间能够进行通讯耦合，使得每个 细胞的节律性振荡同步一致。讨论 哺乳动物体内几乎所有的器官、组织和细胞都具有昼夜节律，与地球上 小时的光暗周期相同步，精密调控机体多种生理功能，包括睡眠、情绪、代谢与免疫等，因此生物钟的稳定调控与人体健康密切相关，研究昼夜节律的振荡性质具有重大生理意义。本文利用荧光素酶报告基因系统，通过深度制冷 相机长时间的曝光延时成像，获得了高信噪比的自发荧光时间序列图像，从较长的时间跨度上研究 昼夜节律基因的振荡特性，得出结论：细胞间的通讯耦合作用使得不同细胞节律基因的表达振荡同步一致，从而向外周时钟提供强劲有力的输出信号，维持全身昼夜节律系统的稳定。神经元间的耦合作用，实现了不同细胞节律性变化的步调一致性，对于维持机体内部生物钟稳定、抵抗外界环境因素干扰至关重要，与人体倒时差的适
