1、实验4 动植物细胞器分离(fnl)、制备与观察,I 线粒体制备与活性鉴定【目的】1掌握分离(fnl)制备动物和植物细胞线粒体的方法。2对分离得到的线粒体进行活性鉴定。【原理】线粒体（mitochondria）是真核细胞特有的，司能量转换的重要细胞器。细胞中的能源物质脂肪、糖、部分氨基酸在此进行最终的氧化，并通过藕联磷酸化生成ATP，供给细胞生理活动之需。,第一页，共二十六页。,将动植物组织制成匀浆，在适当的悬浮介质中用差速离心法可以分离细胞(xbo)线粒体。在一定的离心场中(选用离心机的一定转速)，球心颗粒的沉降速度取决于它的密度、半径和悬浮介质的黏度。在一均匀悬浮介质中离心一定时间，组织匀浆
2、中的各种细胞器及其他内含物由于沉降速度不同将停留在高低不同的位置。依次增加离心力和离心时间，就能够使这些颗粒按其大小、轻重分批沉降在离心管底部，从而分批收集。细胞器沉降先后顺序是细胞核、线粒体、溶酶体和其他微体、核糖体和大分子。,第二页，共二十六页。,悬浮介质通常采用缓冲(hunchng)的蔗糖溶液，它较接近细胞质的分散相，在一定程度上能保持细胞器的结构和酶的活性；pH7.2的条件下；亚细胞组分不容易重新聚集成团，有利于分离。整个操作过程样品要保持在04，避免酶失活。,第三页，共二十六页。,细胞器标记酶的测定是评价细胞器内膜组分和分离纯度的主要依据，如线粒体内膜上分布(fnb)有细胞色素氧化酶
3、，该酶使詹纳斯绿B染料保持在氧化状态呈现蓝绿色从而使线粒体显色，而胞质中的染料被还原成无色。,第四页，共二十六页。,詹纳斯绿B是一种活体染料，能对动、植物的细胞或组织在活体状态下进行无毒害的染色。由于染料(碱性染料)的胶粒表面带有阳离子，酸性染料的胶粒表面带阴离子，而被染部分本身具有(jyu)阴离子或阳离子，这样，它们彼此之间发生吸引作用，染料就被堆集下来。染色法可以显示出活细胞内的某种天然结构存在的真实性，而不影响细胞的生命活动和产生任何物理、化学变化以至引起细胞的死亡。,第五页，共二十六页。,鼠肝线粒体的分离(fnl),【材料】鼠肝脏或猪肝脏。【实验用品】1试剂：(1)0.25 molL蔗
4、糖+0.01 molL三羟甲基氨基甲烷(Tris)一盐酸缓冲液(pH 7.4)：0.1 molL三羟甲基氨基甲烷溶液(rngy)10 mL 0.1 molL盐酸 8.4 mL 加双蒸水到100 mL，再加蔗糖使浓度为0.25 molL。(2)0.34 molL蔗糖+0.01 molL Tris一盐酸缓冲液(pH7.4)，配法同上。,第六页，共二十六页。,(3)1詹纳斯绿B(Janus green B)染液，称取50 mg詹纳斯绿B液溶于5mL生理盐水中，稍微加热使之溶解后，过滤，即为1原液。(4)姬姆萨染液(Giemsa)：称取Giemsa粉0.5 g、甘油33 mL、纯甲醇(ji chn)3
5、3 mL。先在Giemsa粉中加少量甘油，然后在研钵内研磨至无颗粒状，再将剩余甘油倒入混匀，56左右保温2 h，使其充分溶解，最后加甲醇混匀，成为Giemsa原液，保存于棕色瓶。使用时吸出少量用115molL磷酸缓冲液作1020倍稀释。,第七页，共二十六页。,(5)115 molL磷酸缓冲液(pH 6.8)：115 molL磷酸二氢钾(KH2PO4)50 mL115 molL磷酸氢二钠(Na2HPO4)50 mL(6)卡诺(k nu)(Cornay)固定液：无水乙醇 6 mL 冰醋酸 1 mL 氯 仿 3 mL(7)生理盐水,第八页，共二十六页。,2器具(qj)：,解剖刀，剪刀，漏斗，玻璃匀浆
6、器，尼龙织物(zhw)，刻度离心管，显微镜，冷冻高速离心机。,第九页，共二十六页。,【实验(shyn)步骤】,1制备肝细胞匀浆：实验前将鼠空腹12小时，击头处死，剖腹(pu f)取肝，迅速用生理盐水洗净血水，用滤纸吸干水，称取肝组织2 g，剪碎；用预冷的0.25 molL蔗糖溶液洗涤数次。然后按每克肝加4.5 mL预冷的0.25 molL蔗糖溶液的量，分数次添加蔗糖溶液，在04冰浴中用玻璃匀浆器将肝制成匀浆，用双层纱布过滤。,第十页，共二十六页。,2差速离心：将0.34 molL蔗糖溶液4.5mL放入离心管，然后沿管壁小心地加入4.5mL鼠肝匀浆覆盖(fgi)于上层。用冷冻控温的高速离心按下图
7、顺序进行差速离心。,第十一页，共二十六页。,分离(fnl)细胞核：,鼠肝匀浆700g离心(lxn)10 min 沉淀(细胞核及质膜碎片)上清液(1)洗涤(0.25 molL预冷蔗糖溶液5 mL洗涤2次，每次1000g离心15 min。沉淀(细胞核及质膜碎片)上清液(2)与上清(1)合并,第十二页，共二十六页。,分离(fnl)线粒体：,混合上清液10000g离心10 min沉淀(线粒体)上清液(弃去)洗涤加预冷的0.25 molL蔗糖溶液(rngy)10 mL，10000g离心10 min沉淀(纯化的线粒体)上清液(弃去),第十三页，共二十六页。,3活性鉴定(jindng)：,(1)细胞核：取核
8、沉淀1滴涂于载玻片，加入Carnoy固定液15 min，晾干。Giemsa染液染10 min，蒸馏水漂洗数秒，用滤纸吸干水、用显微镜(40)检查(jinch)，细胞核呈紫红色，混杂的胞质为浅蓝色碎片。(2)线粒体：取线粒体沉淀滴在载玻片上，勿太密。滴加1詹钠斯绿溶液染液，10 min后用光学显微镜观察，线粒体蓝绿色，呈小棒状或哑铃状。,第十四页，共二十六页。,玉米(ym)线粒体的分离,从植物细胞分离线粒体，除了作线粒体功能测定外，在植物细胞遗传工程中，常用于分离核外基因线粒体DNA等目的。分离线粒体的方法仍采用均匀(jnyn)介质中的差速离心。介质中0.25mol/L蔗糖也可以用0.3mol/
9、L甘露醇代替。EDTA整合二价阳离子，Ca2除去后细胞间粘着解体，促使组织分散成单个细胞。牛血清白蛋白(BSA)能包在细胞外面，并作为竞争性底物削弱蛋白酶的作用。,第十五页，共二十六页。,【材料】玉米黄化幼苗(水稻、高粱等幼苗均可)。【实验用品】1试剂(shj)：（1）分离介质：0.25mol/L蔗糖，50mmol/L的Tris-盐酸缓冲液(pH7.4)，3mmol/LEDTA，0.75mg/mL牛血清白蛋白(BSA)。50mmol/L的Tris-Hcl缓冲液(pH7.4)配法：50mL0.1mol/L三羟甲基氨基甲烷(Tris)溶液与42mL 0.1mol/L盐酸混匀后，加水稀释至100mL
10、。,第十六页，共二十六页。,（2）保存液：0.3mol/L甘露醇(pH7.4)（3）20次氯酸钠(NaClO)溶液(rngy)。（4）1詹纳斯绿B染液，用生理盐水配制。2器材：温箱、冰箱、纱布、瓷研钵、冷冻控温高速离心机。,第十七页，共二十六页。,【实验(shyn)步骤】,1玉米种子用20次氯酸钠溶液浸泡10min消毒，清水冲洗30min，再浸泡清水15h。将种子平铺在放有湿纱布(shb)的盘内，保持湿度，置温箱28于暗处培育23d。待芽长到12cm长时剪下约15g，放041h。2加3倍体积分离介质，在瓷研钵内快速研磨成匀浆。3用多层纱布过滤，滤液经700g离心10min。除去核和杂质沉淀。4
11、取上清液10000g离心10min，沉淀为线粒体。再同上离心洗涤一次。5沉淀为线粒体，可存于0.3mol/L甘露醇中。注意以上匀浆化及离心均控制在04进行。6线粒体的观察：取线粒体沉淀涂在清洁的载玻片上，不待干立即滴加1詹纳斯绿B染色20min，放上盖玻片，用显微镜观察，线粒体是蓝绿色圆形颗粒。,第十八页，共二十六页。,【注意事项】实验全过程要求在04进行，如果使用非冷冻控温的离心机，一般(ybn)只宜分离细胞核和线粒体，同时注意使样品保持冷冻；尽可能充分破碎组织、缩短匀浆时间。整个分离过程不宜过长。【实验报告】绘制线粒体示意图。,第十九页，共二十六页。,II 叶绿体的分离与荧光(ynggun
12、g)观察,【目的】了解叶绿体分离的一般原理和方法，并熟悉应用荧光显微镜方法观察叶绿体荧光现象。【原理】叶绿体是植物细胞中较大的一种细胞器，能发生特有的能量转换。利用低速离心机可以分离叶绿体，其分离在等渗溶液(035 molL氯化钠或04 molL蔗糖溶液)中进行，目的是为了防止渗透压的改变引起叶绿体的损伤。将匀浆液在1000 rmin离心，去除其中的组织(zzh)残渣和一些未被破碎的完整细胞，然后，3000 rmin离心，可获得沉淀的叶绿体(混有部分细胞核)。在室温下进行分离要迅速。,第二十页，共二十六页。,某些物质(wzh)在一定短波长的光(如紫外光)的照射下吸收光能进入激发态，从激发态回到
13、基态时，就能在极短的时间内放射出比照射光波长更长的光(如可见光)，这种光就称为荧光。若停止供能荧光现象立即停止。有些生物体内的物质受激发光照射后，可直接发出荧光(称为自发荧光)，如叶绿素的火红色荧光。有的生物材料本身不发荧光，但它吸收荧光染料后同样也能发出荧光(称为间接荧光)，如叶绿体吸附吖啶橙后可发橘红色荧光。本实验利用荧光显微镜对发荧光的叶绿体进行观察。,第二十一页，共二十六页。,【材料】菠莱叶片。【实验用品】1试剂：蒸馏水，0.35 molL氯化钠溶液，0.01吖啶橙。2器材：普通离心机，组织捣碎(do su)机，天平，荧光显微镜，显微镜，载玻片，盖玻片，镊子，接种针，目镜测微尺，物镜测
14、微尺，恒温箱，培养皿，滤纸，试管，试管架，移液管，滴管，烧杯，无荧光载片，盖玻片，离心管。,第二十二页，共二十六页。,【实验(shyn)步骤】,1选取新鲜的菠菜嫩叶，洗擦干后去除叶梗及粗脉，称3g于0.35 molL氯化钠溶液45mL中，置入组织捣碎机或研钵中。2利用组织捣碎机低速(5000 rmin)匀浆35 min，或研磨成匀浆。3用6层纱布过滤，滤液(ly)盛于烧杯中。4取滤液4 mL在1000 rmin下离心2 min，弃去沉淀。5将上清液在3000 rmin下离心5 min弃去上清液，沉淀即为叶绿体(混有部分细胞核)。,第二十三页，共二十六页。,6沉淀用0.35 molL氯化钠溶液悬
15、浮。7取叶绿体悬液l滴置于载玻片上，加盖玻片后用普通(ptng)光学显微镜观察。使用荧光显微镜观察时，将叶绿体悬液滴在无荧光的载玻片上，再滴加l滴0.01吖啶橙荧光染料，盖上无荧光的盖玻片后即可观察。8观察叶绿体的形态结构、测量510个叶绿体的长轴和短轴、叶绿体发射荧光的现象。,第二十四页，共二十六页。,【实验报告】,绘制普通光学显微镜下观察的叶绿体形态示意图，记录(jl)荧光显微镜观察的现象，分析结果。,第二十五页，共二十六页。,内容(nirng)总结,实验4 动植物细胞器分离、制备与观察。依次增加离心力和离心时间，就能够使这些颗粒按其大小、轻重分批沉降在离心管底部，从而分批收集。整个操作过程样品要保持在04，避免酶失活。将0.34 molL蔗糖(zhtng)溶液4.5mL放入离心管，然后沿管壁小心地加入4.5mL鼠肝匀浆覆盖于上层。将种子平铺在放有湿纱布的盘内，保持湿度，置温箱28于暗处培育23d。待芽长到12cm长时剪下约15g，放041h,第二十六页，共二十六页。,
