1、碧迪医疗器械（上海）有限公司(yu xin n s)上海市静安嘉里中心3座10楼李苏辉,流式细胞仪原理(yunl)及仪器维护保养,第一页，共五十三页。,白细胞的组成(z chn),白细胞的组成及其分化抗原白细胞在分化成熟过程中，不同的发育阶段和不同亚类的白细胞出现或消失的表面标记，这是区分白细胞的重要标志(biozh)。1986年世界卫生组织命名委员会建议应用CD系列来统一命名白细胞分化抗原,第二页，共五十三页。,SHA-LFR032-20080930-4N 13E for Jerel,细胞毒性T淋巴细胞;分泌(fnm)穿孔素、IFN、TNF等。特点：MHC-1类分子限制、直接接触、反复杀伤,
2、自然杀伤细胞（NK)：抗体依赖(yli)细胞介导的细胞毒作用、淋巴因子介导细胞毒作用、,抗体依赖的细胞(xbo)介导的细胞(xbo)毒作用,补体系统的活化（经典、凝集素、替代途径）。作用（溶胞作用、吞噬条理作用、趋化性、炎症反应等）,中和抗原：形成免疫复合物，被吞噬细胞清除（条理作用）、毒素中和作用、感染中和作用,体液免疫和细胞免疫的作用,淋巴因子依赖的细胞毒作用,第三页，共五十三页。,免疫应答的过程及Th细胞(xbo)的作用,免疫应答：细胞(xbo)免疫体液免疫Th细胞作用：Th1分泌IL-2、INF等，前者可诱导Th、Tc分裂增值；Th2分泌IL-4、IL-5,可使B细胞活化，产生抗体B细
3、胞完全活化需要Th帮助,第四页，共五十三页。,流式细胞仪原理(yunl),流式细胞术(Flow cytometry)对于处在流动状态的细胞(xbo)或生物颗粒同时进行多参数的快速的分析和定量的技术,第五页，共五十三页。,BD公司(n s)HIV领域流式细胞仪产品,FACSCount流式细胞仪,FACSCalibur流式细胞仪,第六页，共五十三页。,T,T,C,H,CD3,CD3,CD8,CD4,流式细胞仪检测原理(yunl)及在T细胞分析中应用,第七页，共五十三页。,Analyze,第八页，共五十三页。,激发光源与荧光(ynggung)标记物,第九页，共五十三页。,FACSCalibur流式细
4、胞仪仪器(yq)结构,液流系统光学系统激光光源(gungyun)光收集系统电子系统光电转换数据处理系统软件系统,第十页，共五十三页。,液流系统(xtng)-鞘液,第十一页，共五十三页。,流式细胞仪原理(yunl),第十二页，共五十三页。,光学系统,激光(Laser,light amplification by stimulated emission of radiation)是一种相干光源，它能提供单一波长(bchng)、高强度及稳定性高的光照激光波长:488nm,635nm,第十三页，共五十三页。,检测(jin c)信号,散射光信号FSC:前向角散射光SSC:侧向(c xin)角散射光(90
5、度散射光)荧光信号荧光染料光学滤片,第十四页，共五十三页。,检测(jin c)信号,第十五页，共五十三页。,前向角散射光信号(xnho),第十六页，共五十三页。,前向角散射光信号(xnho),第十七页，共五十三页。,散射光信号(xnho)前向角散射光信号(FSC),FSC-Forward(Angel Light)Scatter在激光束正前方的检测器,为前向散射光检测器 FSC的强度与细胞(xbo)或其他颗粒的大小,形状及 optical homogeneity 有关FSC用于检测细胞或其他粒子的表面属性如:大小,第十八页，共五十三页。,侧向(c xin)角散射光信号,第十九页，共五十三页。,侧
6、向(c xin)角散射光信号,第二十页，共五十三页。,侧向(c xin)角散射光信号(SSC),SSC-Side(Angel Light)Scatter 与激光束垂直方向的检测器为侧向检测器,也称为90度散射光检测器 SSC的强度与细胞或其他颗粒的大小,形状及 optical homogeneity 有关(yugun)SSC用于检测细胞内部结构如:胞浆内颗粒多少,核质比,第二十一页，共五十三页。,流式细胞仪的检测(jin c)信号：散射光,FSC，前向角散射光，代表细胞大小(dxio)SSC，侧向角散射光，代表细胞粒度,Right Angle Light Detector Cell Compl
7、exitySSC,Forward Light Detector Cell Surface Area FSC,Incident Light Source,第二十二页，共五十三页。,荧光(ynggung)信号,每种荧光染料均有特定(tdng)的激发波长,并激发后会有发射波长,流式细胞仪检测的即是它特定的发射波长.利用各种不同波长的光学滤片来收集(检测)这些光学信号,第二十三页，共五十三页。,光学系统,FCM的光学系统是由若干组透镜(tujng),滤波片,小孔组成,第二十四页，共五十三页。,光路-滤片特性(txng),长通滤片 允许长于(chngy)设定波长的光通过 短通滤片 允许短于设定波长的光通
8、过 带通滤片 允许一定带宽的波长通过,第二十五页，共五十三页。,460 500 540,460 500 540,460 500 540,SP 500,LP 500,BP500/50,长通 短通 带通,光学(gungxu)滤片,第二十六页，共五十三页。,荧光(ynggung)信号,第二十七页，共五十三页。,荧光(ynggung)信号,第二十八页，共五十三页。,光路-滤片特性(txng),当以 45o 角放置长通滤片时,该滤片可以通过一定波长的光,同时也可以阻断并折射该波长以下的光 这种方式(fngsh)的滤片称为二向色性长通滤片(dichroic filter),第二十九页，共五十三页。,第三十
9、页，共五十三页。,光学系统,第三十一页，共五十三页。,电子系统,当细胞携带荧光素标记物,通过激光照射区时,受激激发,产生代表细胞内不同物质、不同波长的荧光信号,这些(zhxi)信号经A/D转换成数字信号,送计算机进行储存、作图、统计分析,第三十二页，共五十三页。,发射(fsh)波长,Wavelength(nm),400,450,500,550,600,650,700,1000,800,600,400,200,0,PE,FITC,PerCP,750,第三十三页，共五十三页。,流式细胞仪原理(yunl),荧光(ynggung)信号,650nm,700nm,500nm,600nm,Relative
10、Intensity,Wavelength(nm),550nm,第三十四页，共五十三页。,检测器,Photomultiplier tube(PMT)将光学信号转变为电脉冲(数字(shz)数据)信号,第三十五页，共五十三页。,单平台(pngti)绝对计数,管中预先(yxin)加有准确定量的Beads流式细胞仪获取数据后，由各目标群的含量，可以计算出相对含量%由各目标群与Beads的相对量计算，得到该细胞群的绝对含量计算公式：细胞获取数Beads总量细胞/L=Beads获取数 样本量注：Beads总量见TruCOUNT管外包装MultiSET系统中，样本量为50 L,第三十六页，共五十三页。,单平台
11、绝对(judu)计数,使用(shyng)TriTEST或MultiTEST试剂，在TruCOUNT管中完成全血的淋巴细胞绝对计数TruCOUNT管中预先加有准确定量的Beads，每批TruCOUNT管的Beads含量一致由各目标群与Beads的相对量计算，得到该细胞群的绝对含量使用直接荧光标记抗体组合，一步处理外周血使用免洗技术，溶血后直接上机检测标本操作简便，省时省力，计数结果重复性好,第三十七页，共五十三页。,淋巴细胞分析(fnx),使用(shyng)特异的单克隆抗体，进行多色分析，同时分析淋巴细胞上多种抗原的表达，可以将淋巴细胞亚群区分开，进行定量分析淋巴细胞分析TriTEST：三色试剂
12、CD4/CD8/CD3，CD3/CD4/CD45MultiTEST：四色试剂CD3/CD8/CD45/CD4TruCOUNT：单平台绝对计数管报告Th,Ts,Th/Ts百分含量%与绝对含量cells/uL,第三十八页，共五十三页。,TriTEST CD4/CD8/CD3,T Lymph EventsCD3+CD4+%T LymphCD3+CD8+%T LymphCD3+CD4+CD8+%T LymphT H/S Ratio,Bead EventsCD3+Abs CntCD3+CD4+Abs CntCD3+CD8+Abs CntCD3+CD4+CD8+Abs Cnt,第三十九页，共五十三页。,淋
13、巴细胞四色分析(fnx),Lymph Abs CntCD3+%LymphCD3+Abs CntCD3+CD4+%Lymph CD3+CD4+Abs CntCD3+CD8+%Lymph CD3+CD8+Abs CntCD3+CD4+CD8+%LymphCD3+CD4+CD8+Abs CntT H/S Ratio,第四十页，共五十三页。,MultiTEST CD3/CD8/CD45/CD4,MultiTEST CD3/CD15+56/CD45/CD19,第四十一页，共五十三页。,FacsCalibur仪器样本(yngbn)操作,仪器(yq)校正：加入校正试剂内的液体必须和鞘液桶的一样。样本操作：溶
14、血、有凝块的血不要做 加样前，抗凝血颠倒混匀810次（避免混匀器混匀）使用反向加样法，枪头贴壁。加样枪在试管内不要放松,第四十二页，共五十三页。,FACSComp没有(mi yu)通过怎么办？,FSC或SSC没有通过：原因：1.由于仪器的管路没有清洗干净2.使用的鞘液杂质太多(换鞘液）BD公司专用(zhunyng)鞘液3.校准品失效4.仪器故障措施：1.用蒸馏水高速运行仪器10分钟30分钟2.过滤鞘液3.使用新的校准品4.致电BD工程师,第四十三页，共五十三页。,FacsCalibur仪器(yq),BD原装鞘液：过滤、消毒。0.22um滤膜过滤鞘液桶放入3升鞘液（不要放满），清除(qngch)
15、废液桶废液，装200毫升漂白剂先开仪器再开电脑在按Prime按钮去除流动池气泡时，上样架处在偏离位置做好每日维护，建议每次关机时做FacsClean和FacsRinse清洗。（1）FacsClean，Run Hi 支架旁位2分钟；支架正位3分钟（2）FacsRinse，步骤同上（3）蒸馏水，Run Hi2分钟旁位，5分钟正位（4）去除鞘液压力（5）选择Standby模式10分钟后关机 月维护中鞘液桶装入FacsClean(0.51的漂白剂)，旁路鞘液过滤器。每3个月6个月清洗空气过滤网（用水冲洗再晾干）。过滤器6个月更换,第四十四页，共五十三页。,FACSCount,第四十五页，共五十三页。,
16、仪器(yq)性能,样本(yngbn)稳定性制备后室温(2025 0C)储存48小时全血稳定性采集后室温(2025 0C)储存48小时,第四十六页，共五十三页。,FacsCount样本(yngbn)处理,FacsCount质控：正常血，样本用前颠倒混匀（避免混匀器上混匀）。反向(fn xin)加样法，枪头贴管壁,分离最后一滴。试剂在开盖前可以在混匀器上颠倒混匀每次更换枪头，样本多时，每次更换试剂对管管盖加入固定液后30分钟以后再操作更安全,第四十七页，共五十三页。,FacsCount仪器(yq),用水冲洗开盖器，用轻柔的去污剂或70酒精清洗电子加样枪,用1：10的漂白剂清洗Workstation避免在废液桶里装高浓度的漂白剂每次试验结束后废液桶必须清空,然后用自来水冲洗.建议关机后取出废液桶,下次实验时再放置在仪器里电子加样枪不用时需从支架上取下.软盘复制（已做过质控的软盘作为母盘）连续做15个标本需要(xyo)做清洗，如果试验中间中断1小时以上，需要清洗；将装有蒸馏水的上样管置于上样针位置，保持上样针湿润，防治结晶；关机。如果长时间不做试验，建议每周用蒸馏水清洗,第四十八页，共五十三页
