1、第四节 酶的人工模拟,一、模拟酶的概念：人工模拟酶就是根据酶的作用原理，用人工的方法合成的具有活性中心和催化作用的蛋白或非蛋白质结构的化合物。模拟酶用合成高分子来模拟酶的结构、特性、作用原理以及酶在生物体内的化学反应，一般具有高效和高适应性的特点，在结构上比天然酶相对(xingdu)简单。模拟酶不仅在分子水平上模拟酶活性部位的形状、大小及其微环境等结构特征，更重要的是它能摸拟酶的作用机制和立体化学等特性。,第一页，共五十一页。,二、模拟(mn)酶的理论基础,1.模拟酶的酶学基础Pauling稳定(wndng)过渡态理论：酶先与底物结合，进而选择性地稳定(wndng)某一特定反应的过渡态（TS）
2、，降低反应活化能，从而加快反应速度。模拟酶要和酶一样，能够在结合底物过程中，通过底物的定向化、键的扭曲及变形来降低反应的活化能。,第二页，共五十一页。,第三页，共五十一页。,第四页，共五十一页。,2.主-客体化学和超分子化学主-客体化学的基本意义来源于酶和底物的相互作用，体现为主体(zht)和客体在结合部位的客间及电子排列的互补。超分子的形成源于底受和受体的结合，这种结合基于非共价键相互作用，超分子兼具分子识别、催化和选择性输出的功能。主-客体化学和超分子化学已经成为酶人工模拟的重要理论基础，是人工模拟酶研究的重要理论武器。,第五页，共五十一页。,三、模拟(mn)酶的分类,根据Kirby分类法
3、，模拟酶可分为：单纯酶模型：以化学方法通过天然酶活性的模拟来重建和改造酶活性。机制酶模型：通过对酶作用机制诸如识别(shbi)、结合和过渡态稳定化的认识，来指导酶模型的设计和生产。单纯合成的酶样化合物：一些化学合成的具有酶样催化活性的简单分子。,第六页，共五十一页。,按照模拟(mn)酶的属性，可分为：主-客体酶（环糊精、冠醚、穴醚、杂环大环化合物和卟啉类等）胶束酶肽酶半合成酶分子印迹酶,第七页，共五十一页。,1.主-客体(kt)酶模型,优良的模拟酶环糊精（cyclodextrin，CD）。能提供一个疏水的结合部位并能与一些无机和有机分子形成包结络合物，以此影响和催化一些反应。由几个D-(+)-
4、吡喃葡萄糖残基通过-1，4糖苷键连接而成。每个葡萄糖残基呈现椅式构象，整个分子类似环柱形分子，由于环糊精分子空穴边缘有许多羟基，能溶于水，空穴内基本是疏水的。环糊精催化的特点是：参与反应的底物分子先被环糊精分子包接，再于其发生反应，与酶促反应十分相似，已模拟了转氨酶、核糖核酸酶、碳酸苷酶等。除了环糊精等天然存在(cnzi)的宿主酶模型外，人们还合成了冠醚、穴醚、环番、环芳烃等大环多齿配体来构建酶模型。,第八页，共五十一页。,第九页，共五十一页。,2.胶束模拟(mn)酶,胶束在水溶液中提供了疏水微环境，可以对底物束缚，如果再在胶束上共价或非共价结合了催化基团和一些辅酶后，就有可能提供“活性中心”
5、部位(bwi)，使胶束成为具有酶活力或部分酶活力的胶束模拟酸。目前比较重要的胶束酶模型有：模拟水解酶的胶束酶模型辅酶的胶束酶模型金属胶束酶模型,第十页，共五十一页。,3.肽酶,肽酶就是模拟(mn)天然酶活性部位而人工合成的具有催化活性的多肽。,4.半合成酶,以天然酶为母体，用化学方法或基因工程方法引进适当的活性部位或催化基团(j tun)，从而形成一种新的人工酶。,第十一页，共五十一页。,5.印迹(yn j)酶,分子印迹：制备对某一特定分子具有选择性的聚合物的过程。该特定分子称为印迹分子或模板。（1）分子印迹的原理分子印迹的过程：1、选定印迹分子和功能单位，让它们(t men)之间发生互补作用
6、，形成印迹分子功能单位复合物。2、用交联剂在印迹分子功能单位复合物周围发生聚合反应，形成交联的聚合物。3、从聚合物中除去印迹分子，得到对印迹分子具有选择性的聚合物。,第十二页，共五十一页。,第十三页，共五十一页。,第十四页，共五十一页。,（2）印迹(yn j)分子与单体相互作用的类型,印迹方法：共价分子印迹和非共价分子印迹。非共价分子印迹：首先是印迹分子与功能单位相混合，二者以非共价键发生反应，然后功能单位与交联剂发生共聚合，形成高交联的刚性聚合物，最后使印迹分子从聚合物上脱离，并留下一个在形状和功能基团位置上与印迹分子相互补的识别部位(bwi)。共价 分子印迹：印迹分子与功能基团形成共价键，
7、在与交联剂发生共聚合后，用化学方法将印迹分子从这个高度交联的聚合物上除去。,第十五页，共五十一页。,（3）分子印迹酶通过分子印迹技术可以产生类似于酶的活性中心的空腔，对底物产生有效的结合作用，利用(lyng)此技术可以在结合部位的空腔内诱导产生催化基团，并与底物定向排列。应用范围：分子印迹聚合物可作为剪裁分离物质的材料；在酶技术和有机合成中，可作为模拟抗体、模拟酶或具有催化活性的聚合物；在生物传感器的构建中作为传感器。,第十六页，共五十一页。,制备具有酶活性的分子印迹酶，要选择合适的印迹分子，目前所选择的印迹分子主要有底物、底物类似物、酶抑制剂、过渡态类似物和产物等。催化活性基团的引入：将催化
8、基团定位在印迹空腔的合适位置对印迹酶发挥(fhu)催化效率相当重要。通常引入催化基团的方法为诱导法，即通过相反电荷等相互作用引入互补基团。,第十七页，共五十一页。,（4）生物印迹酶生物印迹是分子印迹的一种形式，它以天然的生物材料，如蛋白质和糖类物质为骨架，在其上进行分子印迹而产生对印迹分子具有特异性识别(shbi)空腔的过程。用这种方法可以制备生物印迹酶。以蛋白质为基础制备生物印迹酶的主要过程为：使蛋白质部分变性；加入印迹分子，使之与部分变性的蛋白质充分结合；用交联剂交联印迹的蛋白质；透析等方法除去印迹分子。,第十八页，共五十一页。,第五节 酶的化学修饰,一、目的(md)和意义天然酶的缺陷：易
9、于变性失活（酸、碱、有机溶剂、热）；容易受产物和抑制剂的抑制；工业反应要求的酸度和温度并不总是在酶反应的最适酸度和温度范围内；底物不溶于水，或酶的米式常数过高；酶做为药物在体内的半衰期较短等因素限制了酶制剂的应用。酶的化学修饰：对酶在分子水平上用化学方法进行改造，即在体外将酶分子通过人工方法与一些化学基团，特别是具有生物相容性的大分子进行共价连接，从而改变酶分子的酶学性质的技术。目的：提高酶的稳定性、降低或消除酶分子的免疫原性（医药）。意义：扩大了酶制剂的应用范围，同时化学修饰法也是研究酶的活性中心性质的重要手段。,第十九页，共五十一页。,2、常用化学修饰剂要求：较大相对分子量；良好(ling
10、ho)的生物相容性和水容性；分子表面有较多的反应活性基团；修饰后酶的半衰期较长。常用修饰剂：糖及糖的衍生物，右旋糖苷、右旋糖苷硫酸酯，糖肽，葡聚糖凝胶，聚乳；高分子多聚物，聚乙二醇，聚乙烯醇；生物大分子，肝素，血浆蛋白质，聚氨基酸；双功能试剂，戊二醛，二胺；其他，固定化酶载体，糖基化试剂，甲基化试剂，乙基化试剂和小分子有机化合物。,第二十页，共五十一页。,3、修饰方法（1）修饰酶的功能基团，酶分子中可解离的基团如氨基、羟基、羧基、巯基等都可以修饰。如脱氨基可消除酶分子表面氨基酸的电荷；通过碳二亚胺反应，可以改变侧链羧基的性质；通过酰化反应可改变侧链羟基的性质。（2）酶分子内或分子间进行交联，应
11、用某些双功能试剂可将酶蛋白(dnbi)分子之间、亚基之间或分子内部不同肽链部分进行共价交联。（3）修饰酶的辅因子，可将辅因子共价结合在酶分子上，或引入新的或修饰过的具有强反应性的辅因子。（4）酶与高分子化合物结合，蛋白质或多糖结合后可提高稳定性。,第二十一页，共五十一页。,4、修饰酶的特性稳定性提高、抗各类失活因子的能力提高、抗原性消除、体内半衰期延长、最适酸度改变、酶学性质改变，对组织分布能力改变。5、前景酶分子经过化学修饰后，并不是所有的缺点都可以克服了，并且修饰的结果难以预测，今后，应选用更多的、合适的修饰方法，如使用基因工程法、蛋白质工程法、人工模拟法和某些(mu xi)物理修饰法等，
12、使酶的性质进一步改善。,第二十二页，共五十一页。,第六节 酶工程研究(ynji)的进展,一、有机相的酶反应20世纪80年代中期，A.M.Klibanov等人打破传统酶学思想的束缚，将酶引入到非水介质中进行催化反应，开辟了非水酶学（nonaqueous enzymology）这一新的研究领域，极大地拓宽了酶的应用范围。非水酶学的提出，为酶在医药、精细化工、材料科学等领域的应用开辟了广阔(gungku)的前景。,第二十三页，共五十一页。,有机(yuj)相的酶反应,1、有机相酶反应的优点 增加疏水性底物或产物的溶解度；热力学平衡向合成方向移动；可抑制有水参与的副反应；酶不溶于有机溶剂，易于回收在利用
13、；容易从低沸点的溶剂中分离纯化产物；酶的热稳定性提高，酸度适用范围扩大；无微生物污染；能测定某些在水介质中不能测定的常数；固定化酶方法简单，可以只沉淀(chndin)在载体表面。,第二十四页，共五十一页。,2、有机相酶反应的溶剂(rngj)体系 水-水溶性溶剂均相体系；水-水不溶性溶剂两相体系；胶束与反相胶束体系，单相有机溶剂体系。,第二十五页，共五十一页。,3.水和溶剂对有机溶剂中酶的影响酶活力 疏水性越强的溶剂，其中酶所要求的水量越少；亲水性强的溶剂应加入更多的水以维持酶活力。酶选择性 取决于酶分子的结构，会因酶所处的溶剂不同而发生(fshng)巨大变化。酶的稳定性 有机溶剂中的水含量对溶
14、剂中酶的稳定性影响很大；有机溶剂中酶的热稳定性随系统水含量增加而下降。,第二十六页，共五十一页。,4.有机相的酶工程 在有机相中，天然酶容易变性而失活、分散性差、容易聚结成团。因此，酶在有机相中的稳定化研究具有重要的意义。固定化酶 不仅使酶在有机相中易于分散，提高扩散效果，而且能增加(zngji)其稳定性，还可以调节和控制酶的活性与选择性，有利于酶的回收和连续化生产。酶的化学修饰和表面活性剂包埋 可以增加酶表面的疏沙发一，改善酶在有机相中的脂溶性和稳定性，提高酶的催化效率。,第二十七页，共五十一页。,二、核酶和脱氧(tu yng)核酶,具有催化活性的RNA，即核酶(ribozyme)。根据其催
15、化的反应可分为两大类：剪切型核酶 催化自身或异体RNA的切割，相当于内切核酸酶，主要(zhyo)包括锤头型核酶、发夹型核酶、丁型肝炎病毒核酶以及蛋白质RNA复合酶（RNaseP）。剪接型核酶 主要包括组内含子和组内含子，可实现mRNA前体自我拼接，具有内切核酶酶和连接酶两种活性。,第二十八页，共五十一页。,切割RNA的DNA分子，称之为脱氧核酶。大多数脱氧核酶的催化需要Mg2+等二价金属离子作为辅助因子。这些离子的作用是：中和DNA单链上的负电荷，从而增加单链DNA的刚性；利用金属螯合作用发挥空间诱导效应；产生H+，诱导并参与体系的电子或质子传递，催化体系发生氧化(ynghu)还原反应。,第二
16、十九页，共五十一页。,三、抗体酶,利用抗体能与抗原特异性结合的原理，可用过渡态类似物作为半抗原来诱发抗体，这样(zhyng)产生的抗体便能特异地识别反应过程中真正的过渡态分子，从而降低反应的活化能，达到催化反应的目的，这种抗体便称为催化抗体。催化抗体是抗体的高度选择性和酶的高效催化能力巧妙结合的产物，本质上是一类具有催化活力的免疫球蛋白，在其可变区赋予了酶的属性，因此也叫抗体酶。抗体酶与天然酶相比，最大优点是：种类繁多，不但能催化一些天然酶能催化的反应，还能催化一些天然酶不能催化的反应。,第三十页，共五十一页。,抗体酶制备方法（1）稳定过渡态法：用类似于反应过渡态的小分子作为半抗原，产生相应的抗体而获得。（2）抗体与半抗原互补法：利用抗体-半抗原互补性产生抗体酶，通过半抗原的优化设计使之正确模仿过渡态的几何结构及所有的反应键，从而(cng r)产生高活力的抗体酶。（3）熵阱法：利用抗体结合能克服反应熵垒来设计半抗原。,第三十一页，共五十一页。,利用(lyng)过渡态类似物制备抗体酶,第三十二页，共五十一页。,（4）多底物类似法：将酶催化反应的辅因子引入到抗体结合部位，产生既有辅因子结合
