1、Chapter 7食品卫生细菌的检测(jin c)技术,第一页，共七十八页。,学习(xux)目标,掌握学习食品中菌落总数检测程序和方法(fngf)。掌握学习食品中大肠菌群检测程序和方法。掌握食品中菌落总数和大肠菌群检测结果的报告方式。,第二页，共七十八页。,主要(zhyo)内容,第三页，共七十八页。,S1 菌落(jnlu)总数的测定,第四页，共七十八页。,一、菌落(jnlu)总数,是指食品检样经过处理，在一定条件(tiojin)下培养后,所得1mL(g)或1cm2面积检样中所含菌落的总数.以菌落形成单位（colony forming unit CFU）表示。,第五页，共七十八页。,二、菌落(j
2、nlu)总数测定的意义,1、判定食品被细菌污染的程度及卫生质量。2、预测食品存用的期限长短(chngdun)。3、了解细菌在食品中的繁殖动态。,第六页，共七十八页。,三、菌落总数测定(cdng)的方法,平板倾注(qngzh)法平板表面涂布法平板表面点滴法,第七页，共七十八页。,四、平板倾注法测定菌落(jnlu)总数,检验(jinyn)步骤(程序)：检样稀释处理做平板培养菌落计数报告结果,第八页，共七十八页。,（一）、样品稀释(xsh)及做平板,1ml,1ml,1ml,1ml,1:10,1:1000,1:100,1:10000,1ml,1ml,1ml,加入(jir)46营养琼脂1215ml,25
3、g/ml样品(yngpn),生理盐水,第九页，共七十八页。,Note：检样从开始稀释到倾注最后一个平皿所用时间不宜(by)超过20min，以防止细菌有所死亡或繁殖,第十页，共七十八页。,（二）培养(piyng),普通(ptng)食品:37 48h 倒放平板清凉饮料、调味品、糕点、酒类：37 24h 水产品:30 48h,第十一页，共七十八页。,（三）计数(j sh)和报告,到达规定培养时间(shjin)，应立即计数。如果不能立即计数，应将平板放置于04，但不得超过24h。,第十二页，共七十八页。,（1）、单个菌做一个菌落(jnlu)计（2）、呈链状生长的菌落之间无任何明显界限，作为一个菌落计，
4、如存在有几条不同来源的链，则每条链均应按一个菌落计算。（3）、如片状菌落不到平板一半，而另一半又分布均匀，则可以半个平板的菌落数乘2代表全平板的菌落数。,1.菌落(jnlu)的选择,第十三页，共七十八页。,2、平板菌落计数(j sh)的选择,（1）、选取菌落数在30300之间的平板（SN标准(biozhn)要求为25250个菌落），若有二个稀释度均在30300之间时，比值小于或等于2取平均数，比值大于2则其较小数字。,第十四页，共七十八页。,（2）、如均大于300，则取最高稀释(xsh)度的平均菌落数乘以稀释(xsh)倍数报告（3）、如均小于30，则以最低稀释度的平均菌落数乘稀释倍数报告（4）
5、、如菌落数有的大于300，有的又小于30，不在30300之间，以最接近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数报告（5）、如所有稀释度均无菌落生长，则应按小于1乘以最低稀释倍数报告。,第十五页，共七十八页。,3、菌落(jnlu)数的报告,菌落数在1100时，按实有数字报告，如大于100时，则报告前面两位有效数字，第三位数按四舍五入计算。固体检样以克（g)为单位报告，液体检样以毫升(ho shn)（ml）为单位报告，表面涂擦则以平方厘米（cm2）报告。,第十六页，共七十八页。,(四)、检验(jinyn)注意事项,1、对照平板出现几个菌落时，要追加对照平板；2、吸管进出瓶子或试管(shgun)时，吸管
6、口不得触及瓶口、管口的外围部分；3、吸管插入试样液内的深度不得小于2.5cm,调整时要使管尖与容器内壁紧贴;4、进行稀释时,吸管口不得与稀释液接触;5、检样从开始稀释到倾注最后一个平皿所用时间不宜超过20min.6、稀释倍数愈高菌落数愈少，稀释倍数愈低菌落数愈多。如出现逆反现象，不可作为检样计数报告的依据。,第十七页，共七十八页。,食品卫生细菌(xjn)的检测技术,三、嗜热菌（芽孢）计数（一）仪器用具 冰箱、培养箱、高压灭菌(mi jn)锅、恒温水浴锅、托盘天平、可调式电炉、吸管、广口瓶、三角瓶、平皿、试管等。（二）培养基和试剂 1葡萄糖-胰蛋白胨琼脂（同上）2亚硫酸盐琼脂 将胰蛋白胨10g、
7、硫酸钠1g、硫乙醇酸钠5g溶解于1000mL蒸馏水中，加入5柠酸酸铁10mL，加入琼脂，加热煮沸，使琼脂溶化，pH自然。分装烧瓶，121高压灭菌20min。3去氧肝汤,第十八页，共七十八页。,食品卫生细菌的检测(jin c)技术,（三）操作步骤 将检样25g加入到盛有225mL无菌水的三角烧瓶内，迅速煮沸5min以杀死细菌繁殖体及耐热性低的芽孢，然后将烧瓶浸于冷水中冷却。1平酸菌计数 在5只无菌培养皿中各注入2mL样液，用葡萄糖-胰蛋白琼脂做倾注平板，凝固后在5055培养4872h，计算5个平板上菌落的平均数。平酸菌在葡萄糖-胰蛋白琼脂平板上的菌落为圆形，直径25mm，具不透明的中心及黄色晕，
8、晕很狭，产酸弱的细菌其菌落周围不存在，或不易观察到。平板从培养箱内取出后应立即进行计数，因为黄色会很快消退(xiotu)。如在培养48h后不易辨别是否产酸，则可培养到72h。,第十九页，共七十八页。,食品卫生细菌(xjn)的检测技术,2不产生硫化氢的嗜热性厌氧菌检验 将已处理过的样品加入等量新制备的去氧肝汤（总量为20mL）于试管中，以2无菌琼脂封顶，先加热到5055，然后在55中培养72h，当有气体生成（琼脂塞破裂，气味(qwi)似干酪）时，可以认为有嗜热性厌氧菌存在。3产生硫化氢的嗜热性厌氧菌计数 将已处理过的样品加入到已熔化的亚硫酸盐琼脂试管中（总量为20mL），共6份。将试管浸于冷水中
9、，培养基固化后，加热到5055，然后在55培养48h。能产生硫化氢的细菌会在亚硫酸盐琼脂管内形成特征性的黑小片（因为硫化氢被转化为硫化铁等硫化物）。计算黑小片数目。某些嗜热菌不生成硫化氢，但代之以生成强大还原性氢，使全部培养基变黑色。,第二十页，共七十八页。,食品卫生细菌的检测(jin c)技术,四、厌氧菌计数（一）仪器用具 冰箱、培养箱、高压灭菌锅、恒温水浴锅、托盘天平(tinpng)、可调式电炉、吸管、广口瓶、三角瓶、平皿、试管等。（二）培养基和试剂 硫乙醇酸盐琼脂的配制：将胰消化干酪素15g、L-胱氨酸0.5g、酵母浸膏5g、葡萄糖5g、氯化钠2.5g、硫乙醇酸钠0.5g、刃天青0.00
10、1g溶解于1000mL蒸馏水中，加入琼脂15g，加热煮沸，使琼脂溶化。调pH为7.07.1，分装烧瓶、试管中，121高压灭菌15min。,第二十一页，共七十八页。,食品卫生细菌的检测(jin c)技术,（三）操作步骤 1倾注平板 将检样稀释液lmL，注入于已溶化并晾至4550的硫乙醇酸钠琼脂管内，摇匀，倾注平板。2叠一层琼脂 冷凝后，在其上再叠一层3无菌琼脂。3培养、计数 凝固(nngg)后，在37培养96h，然后取出进行菌落计数。,第二十二页，共七十八页。,食品卫生细菌(xjn)的检测技术,五、革兰氏阴性菌计数（一）仪器用具 冰箱、培养箱、高压灭菌锅、恒温水浴锅、托盘天平(tinpng)、可
11、调式电炉、吸管、广口瓶、三角瓶、平皿、试管等。（二）培养基和试剂 VRB琼脂的制备：将胰蛋白胨7g、酵母浸膏5g、氯化钠5g、乳糖10g、胆盐1.5 g溶解于1000mL蒸馏水中，加入琼脂15g，加热煮沸，使琼脂溶化，再加入中性红0.03g、结晶紫0.002g，再煮沸2min。pH7.40.2（三）操作步骤 1制备营养琼脂平板 倾注1520mL营养琼脂于无菌培养皿中，凝固后，在37烘去表面水分。,第二十三页，共七十八页。,食品卫生细菌(xjn)的检测技术,2涂布 吸注检样稀释液0.1mL于平板上，共2份，立即用无菌L形玻棒涂开，放置片刻。3层叠VRB琼脂 层叠已溶化并凉到4550的VRB琼脂3
12、4mL。4培养、计数(j sh)在30培养48h后，计数菌落。,第二十四页，共七十八页。,食品卫生细菌(xjn)的检测技术,S2 大肠菌群的测定(cdng),第二十五页，共七十八页。,一、大肠菌群,1、什么是大肠菌群？指一群需氧及兼性厌氧，在37能分解乳糖产酸、产气的革兰氏染色阴性无芽胞杆菌(gnjn)。2、大肠菌群的组成:大肠埃希氏菌发属、柠檬酸杆菌属、产气克雷伯氏菌属和阴沟肠杆菌。,第二十六页，共七十八页。,第二十七页，共七十八页。,1、粪便污染的指标菌：大肠菌群或大肠杆菌2、以大肠菌群作为粪便指标菌原因在粪便中数量最大；在外环境(hunjng)中存活的时间与致病菌大体相同；检测方法简便容
13、易。,二、大肠菌群的测定(cdng)意义,第二十八页，共七十八页。,3、大肠菌群的测定意义（1）、判断食品中否受到粪便污染。（2）、有利于控制肠道传染病的发生(fshng)和流行。（3）、有利于控制食品在生产加工、运输、保存等过程中的卫生状况。,第二十九页，共七十八页。,三、大肠菌群的生物学特性(txng),1.形态与染色(rns)：革兰氏染色(rns)阴性，无芽胞杆菌。2.发酵乳糖产酸产气 3.培养特性：在琼脂上的典型菌落:呈深紫黑色或中心深紫色，圆形，稍凸起，边缘整齐，表面光滑，常有金属光泽；在麦康凯琼脂上的典型菌落:呈桃红色或中心桃红、圆形，扁平，光滑湿润。,第三十页，共七十八页。,EM
14、B平板照片(zhopin)及原理,第三十一页，共七十八页。,麦康凯琼脂(qingzh)平板Age of culture is 24 h,第三十二页，共七十八页。,第三十三页，共七十八页。,大肠杆菌(d chn n jn)平板菌落照片,肠杆菌(gnjn)扫描电镜照片.,第三十四页，共七十八页。,食品卫生细菌(xjn)的检测技术,一、乳糖发酵法（一）原理 由于大肠菌群指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，即：需氧及兼性厌氧、在37能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。因此大肠菌群的检测一般都是按照它的定义进行的。（二）设备和材料 恒温恒湿培养箱（361）、冰箱（04）、显微镜、天平、高
15、压灭菌锅。恒温水浴（44.50.5）。均质器或乳钵(rb)、酒精灯、试管架、平皿（直径为90mm）、试管、吸管、广口瓶或三角烧瓶（500mL）、玻璃珠（直径约5mm）、载玻片、盖玻片等。,第三十五页，共七十八页。,食品卫生细菌的检测(jin c)技术,（三）培养基和试剂 1 乳糖(r tn)胆盐发酵管 成分：蛋白胨 20g、胆盐（猪或牛或羊）5g、乳糖10g、0.04%溴甲酚紫水溶液25mL、蒸馏水1000 mL。制法：将蛋白胨、胆盐、乳糖溶于水中，校正pH7.4，加入指示剂溴甲酚紫，分装于试管，并倒放入一个小试管（杜拉姆发酵管），在121高压灭菌15min，备用。2伊红美蓝琼脂平板（EMB）
16、成分：乳糖10g、蛋白胨10g、磷酸氢二钾2g、琼脂17g、2%伊红Y溶液20mL、0.65%美蓝溶液10mL、蒸馏水1000 mL。制法：先将琼脂加到900mL蒸馏水中，加热溶解，然后加入磷酸氢二钾、蛋白胨，混匀，使之溶解。再以蒸馏水补足至1000mL。校正pH值为7.27.4，分装于烧瓶内，121、15min高压灭菌备用。临用时加入乳糖并加热融化琼脂。冷至60左右以无菌手续加入灭菌的指示剂伊红Y溶液和美蓝溶液，摇匀。倾注平皿，备用。,第三十六页，共七十八页。,食品卫生细菌的检测(jin c)技术,3 乳糖发酵管 成分：蛋白胨20g、乳糖10g、0.04%溴甲酚紫水溶液25mL、蒸馏水1000 mL。制法：将蛋白胨、乳糖溶于水中，校正pH7.4，加入指示剂溴甲酚紫，分装(fn zhun)于试管，并倒放入一个小试管（杜拉姆发酵管），在121高压灭菌15min，备用。4EC肉汤 成分：胰蛋白胨20g、胆盐（3号或混合胆盐）1.5g、乳糖5g、磷酸氢二钾4g、磷酸二氢钾1.5g、氯化钠5g、蒸馏水1000 mL。制法：将上述成分混合溶解后，分装在有发酵倒管的试管中，在121高压灭菌15mi
