1、：基金项 目：年 河 南 省 医 学 科 技 攻 关 计 划 联 合 共 建 项 目（）第一作者简介：董勇，硕士，主治医师，研究方向：肝胆胰腺临床研究。：通讯作者：魏书堂，硕士，副主任医师，研究方向：肝胆胰腺临床研究。：在肝细胞癌中的表达及对细胞生物学的影响董 勇，徐菱遥，华 静，梁 晗，刘东亚，赵俊波，孙正路，程 序，魏书堂河南大学第一附属医院消化内科，河南 开封【摘要】目的 探讨角蛋白（，）在肝细胞癌（，）中的表达及其对细胞增殖、迁移和侵袭的影响。方法 应用免疫组织化学法检测 例 患者癌组织和癌旁正常组织中 蛋白表达，并分析 蛋白表达水平与 患者临床病理特征的相关性。体外培养人正常肝细胞系
2、（）和 细胞系（、和），和 检测细胞中 和蛋白表达。取 细胞和 细胞，构建 敲低 过表达细胞系。法检测细胞增殖活力，实验检测细胞迁移和侵袭能力，检测细胞中 相关蛋白、表达。结果 在 组织 细胞中 蛋白均呈高表达，且 蛋白表达水平与 的肿瘤大小、分期和淋巴结转移有关（均）。敲低 可降低 细胞增殖活力，抑制细胞迁移、侵袭和、表达，升高 表达（均）；过表达可促进 细胞增殖、迁移和侵袭，降低 表达，升高、表达（均）。结论 在 中高表达，敲低 可能通过抑制，抑制 细胞增殖、迁移和侵袭。【关键词】肝细胞癌；角蛋白；上皮间质转化；增殖；迁移；侵袭中图分类号：文献标识码：文章编号：（）收稿日期：，【】（）（）
3、，（）（，），（，），（），（）；，（），【】；肝细胞癌（，）是一种常见的恶性肿瘤，发病率呈上升趋势，并且仍是癌症相关死亡的主要原因。肿瘤生物标志物是癌症患者临床管理的关键组成部分，有助于早期检测、诊断和预测预后或治疗。但在 中，临床实践中纳入的生物标志物很少。因此，识别与 相关的标志物是一个重要的研究领域。角蛋白（，）是角蛋白（，）家族的新成员，已知参与各种类型肿瘤的发生和发展。研究表明，水平与肝病的严重程度密切相关。然而，在 中胃肠病学和肝病学杂志 年 月第 卷第 期 ，的致癌作用尚未阐明，其在癌症中的潜在机制尚不清楚。因此，本研究探讨了 在 中的表达及作用。材料与方法 组织样本来源收集
4、年 月至 年 月在我院确诊为 患者的组织标本，获得了例手术 组织和癌旁正常组织的新鲜样本，所有患者均知情同意，并签署书面知情同意书。手术获得的新鲜样本立即放入液氮中，然后 保存备用。所有样本均经病理证实，所有患者术前均未接受放疗、化疗、生物治疗或其他相关治疗。例患者中男 例，女 例，年龄 岁，中位年龄 岁；肿瘤大小 例，例；高分化 例，中分化 例，低分化 例；根据国际肝癌研究协会 系统，期 例，期 例，期 例，期 例；有淋巴结转移 例，无淋巴结转移 例。本研究经医院伦理委员会批准（批号：）。细胞人正常肝细胞系（）和 细胞系（、和）均购自中国科学院细胞研究所（中国上海）。所有细胞系均在质量浓度为
5、 的胎牛血清（）和 青霉素 链霉素的 培养基中，于 、体积分数为的 的培养箱中培养。每天观察细胞并更换培养基。当细胞达到 的融合度时进行传代。试剂和仪器用于 下调的小分子干扰（）（）和对照干扰质粒（）、用于 过表达的质粒（）和其阴性对照 空载体（）由上海 公司设计和合成。转染试剂（，）；一抗（，）；钙黏附蛋白（，）、神经型钙黏附蛋白（，）、波形蛋白（，）、（）（美国 公司）。多功能酶标仪（美国 公司）；分光光度计（美国 公司）；型荧光定量 仪（美国 公司）；倒置荧光显微镜（日本 公司）。免疫组织化学法检测 组织 癌旁正常组织 蛋白表达将 组织和癌旁正常组织用多聚甲醛固定，然后包埋在石蜡中。之后
6、，将样品切成切片，进行抗原修复后，与 一抗（稀释）在 孵育过夜，然后与二抗（稀释）在 孵育 。洗涤后，切片，用，二氨基联苯胺（）染色，苏木精复染。乙醇和二甲苯分别用于脱水和透明。最后，中性树胶密封。对阴性对照进行与上述类似的步骤，但将 抗体替换为磷酸盐缓冲液（）。肿瘤细胞中具有浅黄色至棕褐色颗粒的区域为 阳性染色。使用染色强度评分和阳性染色细胞百分比来定义 蛋白表达情况。染色强度评分如下：分：阴性（不染色）；分：弱（由细胞质向细胞质膜呈淡黄色弥散分布）；分：中（棕色分布，细颗粒）；分：强（棕色或深棕色分布，细胞质至细胞质膜及细胞核有粗颗粒）。阳性染色细胞百分比评分如下：分：；分：；分：；分：；
7、分：。将染色强度和阳性染色细胞百分比分数相乘以获得 分的最终分数。检测 细胞中 表达使用 试剂分离 细胞总。使用 分光光度计测定 的浓度和纯度。使用逆转录试剂盒合成，并用 在荧光定量 仪上进行实时 分析。使用 方法计算每个样品中 的基因表达水平，为内参对照。其中 正向引物：和反向引物：；正向引物：和反向引物：。检测 细胞中 蛋白和 相关蛋白表达 使用 裂解缓冲液提取 细胞中的总蛋白。使用二辛可宁酸（）测定试剂盒对蛋白质浓度进行定量。制备 十二烷基硫酸钠 聚丙烯酰胺凝胶（）以分离蛋白质样品。将 蛋白质加载到凝胶上，然后转移到聚偏二氟乙烯（）膜上。将膜用质量浓度为 的脱脂牛奶封闭后与一抗（）、（）
8、、（）、（）和（）在 下孵育过夜。然后将膜与 标记的二抗（）一起孵育 。使用增强的化学发光系统（）检测条带。使用 软件量化蛋白质条带，为内参蛋白。细胞转染 将 细胞和 细胞分别在 孔板中以 个细胞 培养，实验分为 对照（）组、组、组和 对照（）组、组、组。待细胞生长至 汇合后，使用 转染试剂将、和 、对应转染到细胞中。转染 后通过 和 分别检测 的基因和蛋白表达。胃肠病学和肝病学杂志 年 月第 卷第 期 ，法检测细胞增殖 转染后，将 细胞和 细胞重悬并调整细胞密度为 个，在 孔板中每孔加入 个细胞，并分别培养 、和 。然后，将 试剂分别加入到每个孔中，并将细胞在 下再培养 。随后，通过酶标仪在
9、 下测量每个孔的光密度（，）值。检测细胞迁移和侵袭转染后，使用 孔 板（孔）进行 细胞的迁移和侵 袭 测 定。将 和 细 胞 悬浮在无血清培养基中（个 细 胞），并 取 细 胞 悬 液 置 于 的 上 室（未 涂 用于迁移，涂有 进行侵袭测定），同时将 含有 的完全培养基添加到小室的下室。培养 后，去除上表面剩余细胞，多 聚 甲 醛 固 定 迁 移 或 侵 袭 的 下 层 细 胞，结晶紫染色 ，每孔随机选取 个视野计数迁移或侵袭细胞数量。统计学分析 采用 软件对数据进行分析，计量资料均符合正态分布，以 表示，采用 检验或单向方差分析与 检验进行统计分析；计数资料以例数 表示，采用检验分析 蛋白
10、表达量与 临床病理特征的关系。为差异有统计学意义。结果 蛋白在 组织中的表达免疫组织化学分析结果显示，蛋白在细胞质中高表达，在细胞核中较少表达，在 组织中 蛋白的染色强度显著高于癌旁正常组织（，见图）。根据 例患者中 蛋白的中位表达水平，将患者分为高表达组（，）和低表达组（，）。蛋白表达与患者年龄、性别和肿瘤分化程度无相关性，与 的肿瘤大小、肿瘤 分期和淋巴结转移有相关性（见表）。注：癌旁正常组织；：组织。图 组织与癌旁正常组织中 蛋白表达（免疫组化，放大 倍）表 患者临床病理特征与 蛋白表达的关系 临床病理特征例数 蛋白表达低（）高（）值年龄 岁 岁性别 男 女肿瘤大小 分期 期 期淋巴结转
11、移 有 无分化程度 低分化 中高分化 和蛋白在不同 细胞系中的表达与人正常肝细胞系 相比，细胞系（、和）中 和蛋白表达均显著升高（）；其中 细胞中 和蛋白表达明显高于其他 细胞，细胞中 和蛋白表达明显低于其他 细胞（见图）。因此，选择 细胞用于 敲低实验，选择 细胞用于 过表达实验。注：与 细胞比较，。图 细胞系中 和蛋白表达 各组转染细胞中 和蛋白表达与 组和 组相比，组 细胞中 和蛋白水平显著降低（）；与 组和 组相比，组 细胞中 和蛋白水平显著升高（，见图）。胃肠病学和肝病学杂志 年 月第 卷第 期 ，注：与 组或 组比较，；与 组或 组比较，。图 各组转染细胞中 和蛋白表达 各组细胞增
12、殖活力 在 、时，与 组和 组相比，组 细胞活力显著降低（）；与 组和 组相比，组 细胞活力显著升高（，见表）。表 各组细胞增殖活力比较（，）（，）组别细胞活力（）组 组 组 组 组 组 值 值 注：与 组或 组比较，；与 组或 组比较，。各组细胞迁移、侵袭能力 与 组和 组相比，组 细胞的迁移和侵袭细胞数量显著减少（）；与 组和 组相比，组 细胞的迁移和侵袭细胞数量显著增加（，见图）。注：与 组或 组比较，；与 组或 组比较，。图 各组细胞迁移、侵袭情况（放大 倍）各组细胞中、蛋白表达 与 组和 组相比，组 细胞中 蛋白水平显著升高，和 蛋白水平显著降低（）；与 组和 组相比，组 细胞中 蛋
13、白水平显著降低，和 蛋白水平显著升高（，见图）。胃肠病学和肝病学杂志 年 月第 卷第 期 ，注：与 组或 组比较，；与 组或 组比较，。图 各组细胞中、蛋白表达 ，讨论 是上皮细胞中间丝的主要成分，在细胞完整性和屏障功能中起重要作用，还参与细胞信号转导、细胞增殖、蛋白质合成和极化细胞结构的维持。在癌症中，被广泛用作诊断性肿瘤标志物。据报道，的异常表达与 发展有关。是 家族新发现的成员，可影响不同类型癌细胞增殖、侵袭和迁移，如卵巢癌、结直肠癌。在本研究中，中 和蛋白表达上调，并通过 促进 细胞增殖、迁移和侵袭。在本研究中，组织中 蛋白和 细胞系中 和蛋白均高表达，并且 蛋白表达与 的肿瘤大小、分
14、期和淋巴结转移有关。表明 可能在 的癌变和进展中发挥作用。据报道，参与卵巢癌、结直肠癌的细胞增殖、迁移和侵袭，。为了探索 在 中的作用和功能，本研究通过用小分子干扰 敲低 或质粒转染过表达 进行了体外细胞实验。结果显示，敲低抑制了 细胞增殖、迁移和侵袭；相反，过表达可促进 细胞增殖、迁移和侵袭；这与既往的研究，结果一致。提示 可能对 细胞的增殖、迁移和侵袭至关重要。是上皮细胞获得间质特征的过程，也是许多恶性肿瘤（包括）的局部和远处转移所必需的转化过程。在 期间，上皮细胞分化以获得间充质特征，为肿瘤细胞提供了迁移和侵袭的能力。后，肿瘤细胞的侵袭能力明显增强。在 侵袭和迁移中的作用已得到广泛验证。
15、上皮标志物 是一种肿瘤抑制蛋白，在 期间 的表达降低，而间充质标志物、的表达增加。研究表明，高 表达及低 表达与 的侵袭性恶性表型相关。在卵巢癌中 敲低促进了 的表达，抑制了、和 的表达，抑制了 中 的发生，减弱了细胞的迁移和侵袭能力。在本研究中，检测结果显示，上皮标志物 的表达水平在 敲低的细胞中增加，而间充质标志物 和 的表达降低；相反，在 过表达细胞中 的表达水平降低，和 的表达水平升高。以上结果表明 参与了 过程。提示，可能通过 调控 细胞的增殖、迁移和侵袭。综上所述，蛋白在 中高表达，其表达水平与 患者的肿瘤大小、分期和淋巴结转移显著相关；敲低 可能通过抑制，抑制 细胞增殖、迁移和侵
16、袭。但仍需体内试验进一步验证 的作用；此外，通过何种途径诱导 仍需要通过实验进一步验证。参考文献 ，（）：，：，（）：，（）：，（）：，胃肠病学和肝病学杂志 年 月第 卷第 期 ，（）：，（）：，（）：，：（），（）：，（）：，（）：，（）：，：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：（上接第 页）李佳璇，于丽华 腺病毒介导 基因过表达对胃癌细胞生长影响 齐鲁医学杂志，（）：，（）：车军，杨柳青，孙斌，等 转录激活 并通过抑制 信号通路抑制肝癌细胞的 过程 肝脏，（）：，（）：，（）：，（）：陈吉，李晞璠，崔宏，等、在结肠癌、腺瘤组织中的表达及意义 胃肠病学和肝病学杂志，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：王凯，郭盼盼，管陈安，等 过表达对卵巢癌 细胞上皮间充质转化的抑制作用及机制研究 浙江医学，（）：，（）：，（）：，：，（）：，（）：胃肠病学和肝病学杂志 年 月第 卷第 期 ，
