1、：基金项目：湖南省卫生健康委科研计划课题项目（）第一作者简介：江少锋，硕士，研究方向：胃肠肿瘤。：通讯作者：贺滢，硕士，研究方向：肿瘤科相关。：过表达 调控结肠癌细胞上皮间质转化的作用及机制研究江少锋，李蓉蓉，贺 滢湖南省肿瘤医院 中南大学湘雅医学院附属肿瘤医院 消化泌尿内一科；教学办，湖南 长沙【摘要】目的 研究叉头框蛋白（，）调控结肠癌细胞上皮间质转化（，）的作用及机制。方法 收集 例手术切除的结肠癌组织及距离病灶边缘 以上的癌旁组织，培养人结直肠癌细胞系、与人正常结肠黏膜上皮细胞，检测 的表达水平。细胞进行分组，转染阴性对照（，）质粒或 质粒，同时加入对照溶剂二甲基亚砜（，）或 连环蛋白
2、（）激动剂，检测细胞迁移率及细胞中 标志基因 钙黏蛋白（）、钙黏蛋白（）、波形蛋白（）的 表达水平，及 蛋白表达水平。结果 结肠癌组织中 的表达水平低于癌旁组织（）；三种结肠癌细胞株中 的表达水平低于 细胞（），且 细胞中 的表达水平低于、细胞（）；与 质粒组比较，质粒组 细胞中、的表达水平增加，迁移率及、的表达水平降低（）；与 质粒组比较，质粒组 细胞的迁移率及、的表达水平增加，的表达水平降低（）。结论 过表达 通过抑制 的方式抑制结肠癌细胞的迁移及。【关键词】结肠癌；叉头框蛋白；迁移；上皮间质转化；连环蛋白中图分类号：文献标识码：文章编号：（）收稿日期：，；，【】（）（），（），（），（）
3、（），（），（），（）【】；结肠癌是我国最常见的消化道恶性肿瘤，但目前结肠癌发病相关的分子机制尚不明确，这极大地限制了结肠癌的早期诊断及靶向治疗。叉头框蛋白（，）属于叉头框蛋白家族，在进化上高度保守，参与胚胎发育、细胞分裂及分胃肠病学和肝病学杂志 年 月第 卷第 期 ，化、能量代谢等过程的调控。近些年的分子生物医学研究认为 在多种恶性肿瘤的发生发展过程中起到抑癌作用，肝癌相关的细胞实验研究结果显示 能够通过抑制 连环蛋白（）表达的方式抑制癌细胞的增殖及上皮间质转化（，）。在结肠癌的发病过程中，是促进病灶生长及浸润的重要生物学环节，与结肠癌复发、转移均密切相关。已有相关研究证实结肠癌病灶内 的表
4、达降低，但 对结肠癌细胞 的调控作用及机制尚不清楚。因此，本研究将探讨 调控结肠癌细胞 的作用及机制，旨在为深入认识结肠癌发病的分子机制提供依据。材料与方法 材料 临床样本：收集 年 月至 年 月在我院手术切除的 例结肠癌组织及对应的距离病灶边缘 以上的 例癌旁组织，术前均未接受过放化疗且均经术后病理确诊为结肠癌。本研究取得医院伦理委员会批准（伦）及入组患者的知情同意。细胞株：人结直肠癌细胞系、与人正常结肠黏膜上皮细胞 购自 公司。试剂与药品：阴性对照（，）质粒、质粒购自上海生工公司，储存液浓度均为 ；转染用脂质体（目录号：）购 自 公 司；激 动 剂（目录号：）购自 公司，储存液用二甲基亚砜
5、（，公司）配置，浓度为 ；总 提取试剂盒（目录号：）、通用反转录试剂盒（目录号：）、荧光定量试剂盒（目录号：）购自北京索莱宝公司；、特异性一抗购自 公司。方法 细胞培养：、细胞在质量浓度为 胎牛血清的培养基中贴壁培养，每 更换 次培养基，待细胞密度为 后用质量浓度为 胰蛋白酶常规进行消化，然后继续传代培养。细胞分组：细胞接种在培养板内，待细胞密度为 后进行分组。组：用 试 剂 转 染 质 粒，质 粒 终 浓 度 为 ；质粒组：用 试剂转染 质粒，质粒终浓度为 ；组：用 试剂转染 质粒，质粒终浓度为 ，同时加入体积分数为 的；质粒组：用 试剂转染 质粒，质粒终浓度为 ，同时加入体积分数为 的；质
6、粒组：用 试剂转染 质粒，质粒终浓度为 ，同时加入，质粒终浓度为 。每组均连续处理 。蛋白表达的 检测：取结肠癌组织、癌旁组织，各约 ，加入裂解液后进行匀浆，匀浆液在 、离心 ，分离上层澄清的组织蛋白样本；细胞接种在 孔培养板中，按照 的方法分组干预 后保留细胞，加入裂解液后用刮刀破碎细胞，细胞后的悬液在、离心 ，分离上层澄清的细胞蛋白样本。蛋白样本用 法检测浓度后取 蛋白加入聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，而后电转至硝酸纤维素膜，质量浓度为 脱脂牛奶室温孵育 ，用 一抗（）、一抗（）或 一抗（）孵 育 过 夜，次 日 室 温 孵 育 二 抗（）。最后将硝酸纤维素膜放入凝胶成像系统，用电化学发光法显影
7、得到、及 的条带，以 的条带灰度值为内参，计算、的相对表达水平。表达的 检测：取结肠癌组织、癌旁组织各约 ，采用总 提取试剂盒提取组织中的总；细胞接种在 孔培养板中，按照 的方法分组干预 后保留细胞，采用总 提取试剂盒提取细胞中的总。采用通用反转录试剂盒 将组织和细胞中的总 反转录为，最后采用 荧光定量试剂盒进行检测，的反应体系为：、反应混合液、上 下 游 引 物 各 、去 离 子 水 补 足 至 。上游引物：，下 游 引 物：；上游引物：，下游引物：；上游引物：，下游引物：；上游引物：，下 游 引 物：。的 反 应 程 序 为：预变性，、特异性退火温度（、）、，共进行 个循环的 反应，反应结
8、束后得到循环曲线及循环胃肠病学和肝病学杂志 年 月第 卷第 期 ，阈值（，），以 为内参，按照公式计算、的 表达水平。细胞迁移的划痕实验检测：用于细胞迁移检测的 细胞接种在 孔培养板内，待细胞铺满后用 的移液头在培养孔中央做一划痕，在显微镜下观察划痕并拍照，用 图像分析图像、得到划痕面积为；按照 的方法进行分组干预，后再次在显微镜下观察划痕并拍照，用 图像分析图像、得到划痕面积为。计算细胞迁移率（）（）。统计学处理采用 软件进行统计学处理，实验数据均为计量资料，以 表示，结肠癌组织与癌旁组织的比较采用配对样本 检验，两组间比较采用独立样本 检验，细胞的三组间比较采用单因素方差分析。为差异有统计
9、学意义。结果 结肠癌组织与癌旁组织中 表达水平的比较 结肠癌组织中 的 相对表达水平及蛋白相对表达水平均低于癌旁组织，差异有统计学意义（，见图）。注：的 表达水平；：的蛋白表达水平。与癌旁组织比较，。图 结肠癌组织与癌旁组织中 表达水平的比较 人结直肠癌细胞、与人正常结肠黏膜上皮细胞 中 表达水平的比较人结直肠癌细胞、中 的 相对表达水平及蛋白相对表达水平均低于人正常结肠黏膜上皮细胞 （），且 细胞中 的 相对表达水平及蛋白相对表达水平均低于、细胞（，见图）。注：的 表达水平；：的蛋白表达水平。与 细胞比较，；与 细胞比较，。图 人结直肠癌细胞与人正常结肠黏膜上皮细胞中 表达水平的比较 转染
10、质粒对 细胞中 表达水平的影响 质粒组 细胞中 的 相对表达水平及蛋白相对表达水平均高于 质粒组（，见图）。过表达 对 细胞迁移及 基因表达的影响 质粒组 细胞的迁移率及、的 相对表达水平均低于 质粒组，的 相对表达水平高于 质粒组（，见表）。过表达 对 细胞中 表达水平的影响 质粒组 细胞中 的蛋白相对表达水平低于 质粒组（，见图）。胃肠病学和肝病学杂志 年 月第 卷第 期 ，注：的 表达水平；：的蛋白表达水平。与 质粒组比较，。图 质粒组与 质粒组 细胞中 表达水平的比较 激动剂对过表达 抑制 细胞中 表达的影响 质粒组 细胞中 的蛋白相对表达水平低于 质粒组（），质粒组 细胞中 的蛋白相
11、对表达水平高于 质粒组（，见图）。激动剂对过表达 抑制 细胞迁移及 基因表达的影响质粒组 细胞的迁移率及、的 相对表达水平均低于 质粒组，的 相对表达水平高于 质粒组（）；质粒组 细胞的迁移率及、的 相对表达水平均高于 质粒组，的 相对表达水平低于 质粒组（，见表）。讨论结肠癌是我国发病率居首位的消化道恶性肿瘤，虽然近些年消化内镜诊疗的发展和推广显著提高了早期结肠癌的检出率，但目前临床上大多数结肠癌患者确诊时已经发展至局部进展期或晚期，治疗后的复发率、转移率、死亡率均较高，整体预后不理想。结肠癌发病的分子机制未明是限制结肠癌临床诊疗的重要原因，不仅不利于发现结肠癌特性的诊断标志物，也不利于发现
12、精准靶向治疗的分子靶点。相关分子生物学研究认为异常激活的 与癌细胞的复发、迁移、浸润、转移密切相关，研究结肠癌 表 质粒组与 质粒组 细胞迁移率及 基因表达的比较（）（）组别次数迁移率 质粒组 质粒组 值 值 的调控机制有望深入认识结肠癌的发病机制。过程是上皮细胞表型向间质细胞表型转化的生物学过程，伴随着 的异常激活，癌细胞间的极性减弱、迁移能力增强，进而会造成癌细胞的局部浸润和远处转移。的上游调控机制复杂，肝癌、卵巢癌相关的细胞实验证实 是 的上游调控分子，敲低 促进癌细胞的，过表达 抑制癌细胞的，提示 对 起到负调控作用。关于结肠癌发病过程中 的生物学作用目前主要停留在临床研究阶段，其他学
13、者的相关研究结果及本研究的结果均证实结肠组织中 的表达水平较癌旁组织明显降低，提示 表达降低与结肠癌的发病有关。在上述临床样本检测的基础上，本研究通过细胞实验观察 对结肠癌细胞 的调控作用及机制。在三种离体培养的结肠癌细胞株中，的表达水平均低于正常结肠黏膜上皮细胞株，这与结肠癌组织中 表达降低的结果吻合。细胞是三种细胞株中 表达水平最低的细胞株，因此选择该细胞株进行后续实验，分析 对结肠癌细胞 的调控作用及机制。经 的质粒转染后，结肠癌细胞中 的表达水平显著增加，同时细胞胃肠病学和肝病学杂志 年 月第 卷第 期 ，注：与 质粒组比较，。图 质粒组与 质粒组 细胞中 表达水平的比较 注：与 质粒
14、组比较，；与 质粒组比较，。图 三组 细胞中 表达水平的比较 表 三组 细胞迁移率及 基因表达的比较（）（）组别次数迁移率 质粒组 质粒组 质粒组 注：与 质粒组比较，；与 质粒组比较，。的迁移能力减弱，上皮标志基因 的表达增加，间质标志基因、的表达降低，表明 对结肠癌细胞的 及迁移具有抑制作用，与 在其他恶性肿瘤细胞中的生物学作用吻合。对下游基因表达的调控作用依赖不同信号通 路 的 转 导，其 中 通 路 介 导 了 的抑癌作用，能够在多种癌细胞中显著抑制该通路的激活，。在胃癌、结直肠癌、食管癌等恶性肿瘤中 通路均过度激活，抑制该通路调控 基因的表达、抑制。本研究过表达 后检测到结肠癌细胞中
15、 的表达降低，表明 抑制结肠癌细胞中 通路的激活。为了进一步认识 通路是否介导 抑制结肠癌细胞，本研究在过表达 的 同 时 使 用 了 该 信 号 通 路 的 激 动 剂，分析结果显示：联合使用激动剂 使 抑制结肠癌细胞迁移及 的作用明显减弱，表明 调控结肠癌细胞 的作用至少部分由 通路介导。综上所述，在结肠癌的发生发展过程中起抑癌作用，过表达 通过抑制 的方式抑制结肠癌细胞的迁移及。未来 有望成为研究结肠癌发病机制及防治手段的新靶点。参考文献 兰蓝，赵飞，蔡玥，等 中国居民 年恶性肿瘤死亡率流行病学特征分析 中华流行病学杂志，（）：，（）：郭天安，谢丽，赵江，等 中国结直肠癌 年发病率和死亡
16、率趋势分析 中华胃肠外科杂志，（）：，（）：，（）：（下转第 页）胃肠病学和肝病学杂志 年 月第 卷第 期 ，（）：，（）：，（）：，：（），（）：，（）：，（）：，（）：，：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：（上接第 页）李佳璇，于丽华 腺病毒介导 基因过表达对胃癌细胞生长影响 齐鲁医学杂志，（）：，（）：车军，杨柳青，孙斌，等 转录激活 并通过抑制 信号通路抑制肝癌细胞的 过程 肝脏，（）：，（）：，（）：，（）：陈吉，李晞璠，崔宏，等、在结肠癌、腺瘤组织中的表达及意义 胃肠病学和肝病学杂志，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：王凯，郭盼盼，管陈安，等 过表达对卵巢癌 细胞上皮间充质转化的抑制作用及机制研究 浙江医学，（）：，（）：，（）：，：，（）：，（）：胃肠病学和肝病学杂志 年 月第 卷第 期 ，
