1、第八讲 生殖发育毒性及其试验与评价方法,第一页，共四十九页。,2,第一节 概述,哺乳动物的生育繁殖过程外源化学物对生殖发育的影响外源化学物对生殖发育损害作用的特点,第二页，共四十九页。,3,哺乳动物的生育繁殖过程,生殖发育是哺乳动物繁衍种族的生理过程，其中包含生殖细胞发生即精子发生和卵细胞发生、配子的释放、性周期和性行为、卵细胞受精、受精卵的卵裂、胚泡的形成、植入或着床、胚胎形成、胚胎发育、器官发生或称器官形成、胎仔发育、分娩和哺乳过程。生殖发育也可称繁殖过程。,第三页，共四十九页。,连续、完整的生殖发育过程的六个阶段,A.从交配前到受孕：检查成年雄性和雌性生殖功能、配子的发育与成熟、交配行为
2、、受精。B.从受孕到着床：检查成年雌性生殖功能、胚胎着床前发育、着床。C.从着床到硬腭闭合：检查成年雌性生殖功能、肧体发育、主要器官形成。D.从硬腭闭合到妊娠结束：检查成年雌性生殖功能、胎体的发育与生长、器官的发育与生长。E.从出生到断乳：检查成年雌性生殖功能、新生仔对宫外生活的适应性、断乳前的发育与生长。F.从断乳到性成熟：检查断乳后的发育与生长、对独立生活的适应、到达完全的性功能。,4,第四页，共四十九页。,5,外源化学物对生殖发育的影响,干扰生殖发育的任何环节，并造成损害作用。可以通过对内分泌系统，特别是对性腺的作用，发生间接的影响。神经系统对内分泌功能也有调节作用，通过下丘脑-垂体-睾
3、丸轴(下丘脑-垂体-卵巢轴)两条途径作用于生殖发育过程。,第五页，共四十九页。,6,外源化学物对生殖发育损害作用的特点,生殖发育过程较机体其他系统更为敏感；外源化学物对生殖发育过程影响的范围较为广泛和深远。不仅直接涉及雌雄两性个体，同时还对其第二代甚至以后世代的个体产生影响。,第六页，共四十九页。,7,第二节 生殖毒性及其评价,生殖毒性的表现生殖毒性的评价方法,第七页，共四十九页。,8,1950年美国霍普金斯大学医院发现，怀孕期间服用黄体酮，先后有600多名女婴出现生殖器男性化畸形。1956年用于治疗妊娠反响的反响停，1961年后出现近万例短肢畸形儿(海豹畸形)。二恶英(TCDD)造成的大面积
4、污染及其与人群生殖危害的关系至今仍不清楚。过去半个世纪震惊全球的系列中毒或灾难事件的发生，在世界范围内提高了人们对用药的平安意识，高度关注新的化学物对生殖内分泌系统或妊娠结局的不良影响，促进了与生殖内分泌系统平安相关法律的产生和研究方法指南的问世。,第八页，共四十九页。,9,一、生殖毒性表现,外源化学物对生殖的过程的损害作用可以表现为性冷淡，性无能或各种形式的性功能减退。雌性可出现排卵规律改变，月经失调或失经，卵巢萎缩，受孕减少，胚胎死亡，生殖能力的降低不孕或不育等。雄性可表现为睾丸萎缩或坏死，精子数目减少。,第九页，共四十九页。,对雄性生殖系统的毒作用,对精子发生的有害作用,继发性的影响精子
5、发生,改变下丘脑-垂体功能,直接影响睾丸细胞功能,精子生成障碍 性欲异常，丧失生育能力 引起生殖细胞突变，造成可遗传损害,10,第十页，共四十九页。,对雌性生殖系统的毒作用,对卵巢的损害：卵母细胞数下降/突变；生长卵泡和成熟卵泡降低，排卵抑制，受孕力下降；干扰卵巢内分泌，影响受精/着床/胚胎发育,生殖道的损害：影响运送卵子/受精/受精卵发育对下丘脑-垂体系统的损害：闭经，受孕力降低。,11,第十一页，共四十九页。,12,是检查外源化学物对动物生育繁殖机能有无损害作用的试验。评定的主要依据是交配后母体受孕情况受孕率、妊娠过程情况正常妊娠率、子代动物分娩出生情况出生存活率、授乳哺育哺育成活率以及断
6、奶后发育情况等。,二、生殖毒性的评价,第十二页，共四十九页。,三段生殖毒性试验,主要是根据发育阶段的区别来设计的，每一段试验大致相当于上述两个阶段。,段：生育力和早期胚胎发育毒性试验一般生殖毒性试验 主要反映妊娠前及妊娠初期的情况段：肧体-胎体毒性试验致畸试验段：出生前后发育毒性试验围生期毒性试验 反映外源化合物对胚胎发育后期、母代分娩过程、哺乳期的影响。,13,第十三页，共四十九页。,段：生育力和早期胚胎发育毒性试验 一般生殖毒性试验,目的：评价受试物对配子成熟、交配行为、生育力、胚 胎着床的影响前述生殖周期的A和B阶段。给药期：雄性从交配前4周开始染毒，并持续至交配成功；雌性交配前2周开始
7、染毒以覆盖34个动情周期，至妊娠第6天受精卵着床。,14,第十四页，共四十九页。,15,受试动物：多用性成熟大鼠，也可用小鼠或家兔 剂量分组：一般设立三个剂量组和两个对照组高剂量组产生轻微毒性病症，但其死亡率不大于10%，也不能完全丧失生育能力。相当于1/10LD50。低剂量组那么不应产生任何可观察到的损害效应。相当于高剂量组的1/30。中剂量组应仅能出现极为轻微的中毒病症。如果1000mg/kg体重剂量对生育力无损害作用，或最高剂量可引起亲代动物表现一般毒性作用，但对生育力无不利影响，那么可不进行其他剂量实验。,一般生殖毒性试验方法原那么,第十五页，共四十九页。,染毒途径:动物接触受试物的方
8、法应参照人类实际接触途径。交配前雄性动物应染毒4-10周，雌性动物2周 一般可混入饲料或饮水中，也可采用灌胃或胶囊法。动物:至少采用一种动物，推荐用大鼠；每组雌雄各20只；雌性动物妊娠13-15天处死，雄性交配成功处死。,16,第十六页，共四十九页。,评价方法,1.雄性生殖毒性评价动物试验 精子生成分析精子计数、形态学及其活率 精子功能检测 睾丸标志酶活性检测 交配实验 显性致死试验,17,第十七页，共四十九页。,18,第十八页，共四十九页。,19,第十九页，共四十九页。,20,三代两窝,2.雌性生殖毒性评价,第二十页，共四十九页。,21,两代一窝(和一代一窝)生殖试验,第二十一页，共四十九页
9、。,22,受孕率:反映雌性动物生育能力以及雌性动物受孕情况 受孕率妊娠雌性动物数交配雌性动物数100正常分娩率:反映雌性动物妊娠过程是否受到影响 幼子出生存活率正常分娩雌性动物数妊娠动物数100幼仔出生存活率:反映雌性动物分娩过程是否正常 幼子出生存活率出生后4天存活幼子数分娩时出生幼子数100幼仔哺育成活率:反映雌性动物授乳哺育幼仔的能力 幼子哺乳成活率21天断乳幼子存活数出生后4天幼子存活数100,观察指标：,第二十二页，共四十九页。,生殖是对亲代动物而言，从配子生成、受精到胎体分娩是一生殖过程。发育主要是对子代而言，从受精卵到性成熟的青春期甚至一直到衰老都属于发育过程。发育毒性也称为胚胎
10、毒性。,23,段：胚体-胎体毒性试验致畸试验,第二十三页，共四十九页。,24,根本概念,1.发育毒性(developmental toxicity)指出生前经父体和(或)母体接触外源性理化因素引起的在子代到达成体之前出现的有害作用，也称为胚胎毒性。具体表现可分为:生长缓慢:即胚胎与胎仔的发育过程在外源化学物影响下，较正常的发育过程缓慢。畸形:由于外源化学物干扰，活产胎仔胎儿出生时，某种器官表现形态结构异常。功能不全:即胎仔的生化、生理、代谢、免疫、神经活动及行为的缺陷或异常。胚胎死亡:某些外源化学物在一定剂量范围内，可在胚胎或胎仔发育期间对胚胎或胎仔具有损害作用，并使其死亡。,第二十四页，共四
11、十九页。,25,2.畸形、畸胎和致畸物 畸形:器官形态的异常。致畸物或致畸原:凡在一定剂量下，能通过母体对胚胎或胎儿正常发育过程造成干扰，使子代出生后具有畸形的化合物。畸胎:具有畸形的胚胎或胎仔。致畸试验:评定外源化学物是否具有致畸作用的试验。3.胚胎毒性作用 外源化学物引起的胎仔生长发育缓慢和功能缺陷不全的损害作用，对母体无显著的毒效应。,第二十五页，共四十九页。,26,4.母体毒性作用 母体毒性作用是指外源化学物在一定剂量下，对受孕母体产生的损害作用。具体表现包括体重减轻、出现某些临床症伏、直至死亡。母体毒性作用与致畸作用关系具有致畸作用，但无母体毒性出现。出现致畸作用的同时也表现母体毒性
12、。不具有特定致畸作用机理，但可破坏母体正常生理稳态。仅具有母体毒性，但不具有致畸作用。在一定剂量下，既不呈现母体毒性，也未见致畸作用。,第二十六页，共四十九页。,27,5.畸形与变异 在胚胎或胎儿出现器官形态结构异常称为畸形。机体的形态结构或生理功能，在同一物种的子代与亲代之间或子代的个体之间，有时出现不完全相同的现象，即为变异。,第二十七页，共四十九页。,28,致畸作用的毒理学特点,器官发生期的胚胎对致畸物最为敏感剂量与效应关系较为复杂剂量效应关系复杂的表现及原因：在一定范围内，畸胎率与剂量成正比，当高到一定水平引起胚胎死亡而掩盖了致畸作用，畸胎率反而会下降。致畸作用的剂量效应曲线较为陡峭，
13、斜率很大。致畸带：从无作用剂量到胚胎死亡剂量的范围,第二十八页，共四十九页。,29,种属差异以及个体差异在致畸作用中较为明显在不同动物并不一定都具有致畸作用，引起畸形的类型也不一致。种间差异即同一物种中不同品系之间存在的差异，在致畸作用中也极明显。,致畸作用的毒理学特点,第二十九页，共四十九页。,30,致畸作用机理,Wilsom(1977)提出了畸形发生的9种机制，包括突变、染色体断裂、有丝分裂改变、改变核酸完整性或功能、减少前体或底物的补给、减少能源支持、改变膜特性、渗透压不平衡和酶抑制作用。近年来在分子水平的研究有很大的进展，虽然胚胎有代偿机制弥补外源性化学物的影响，但是，是否产生畸形依赖
14、于在致病过程中的每个步骤在损伤和修复之间的平衡。,第三十页，共四十九页。,Wilson发育毒理学根本原理,一对致畸的易感性取决于孕体的基因型及其与有害环境因子相互作用的方式。二对致畸的易感性随着对有害因素暴露的发育时期的不同而变化。三致畸物以特异的方式作用机制作用于发育的细胞和组织，启动一系列的异常发育事件细胞病理机制。四有害影响能否接近发育中的组织取决于有害影响本身的性质。五异常发育的四种表型是：死亡、畸形、生长缓慢和功能缺陷。六随着剂量的增加，异常发育表型的频率和程度也随之增加，从无毒作用到全部致死。,第三十一页，共四十九页。,32,基因突变引起胚胎发育异常细胞死亡和增致速度减慢细胞间通讯
15、抑制胚胎中间代谢障碍胚胎组织发育过程的不协调,致畸作用机制,第三十二页，共四十九页。,33,外源化学物发育毒性的评价,传统常规致畸试验主要试验方案：由美国环境保护局EPA首先提出。1.三段生殖毒性试验主要用于评价药物的生殖发育毒性。2.一代和多代生殖毒性试验主要用于评价食品添加剂、农药及其他化学物的生殖发育毒性。3.改进的大鼠发育神经毒性的试验程序。,第三十三页，共四十九页。,34,动物选择:致畸试验的动物选择，除参照毒性试验中选择动物的一般原那么，即食性和对受试物代谢过程与人类接近，体型小，驯服，容易饲养和繁殖及价廉外，还应特别注意妊娠过程较短、每窝产仔数较多和胎盘构造及厚度与人类接近等特点
16、。通常采用两种动物：一种啮齿类，首选大鼠；另一种非啮齿类推荐家兔。,第三十四页，共四十九页。,35,剂量分组：一般应先进行预试，目的是找出引起母体中毒的剂量。最少设3个剂量组，另设对照组。原那么上最高剂量组，可以引起母体轻度中毒，即进食量减少、体重减轻、死亡不超过10%。最低剂量组为无母体和胚胎毒性反响；中间剂量组可以允许母体出现某些极轻微中毒病症。其剂量与高剂量和低剂量成等比级数关系。一般最高剂量不超过LD50的1/51/3，低剂量可为 1100130。,第三十五页，共四十九页。,36,给药期：在胚胎器官形成期连续给药由胚胎着床到硬腭闭合，大鼠孕后615天，家兔618天。由于致畸作用有极为明确的敏感期，应精确掌握动物接触受试物的时间，必须在器官发生期。,第三十六页，共四十九页。,37,动物交配处理：每组动物大鼠或小鼠为1220只，家兔812只，狗等大动物34只。将性成熟雌雄动物按雌雄l：1或2：1比例同笼交配。每日将已确定受孕雌鼠随机分入各剂量组和对照组。出现阴栓或精子之日即为受孕0日，也有人作为第1日。,第三十七页，共四十九页。,38,胎仔检查：自然分娩前1-2日将受孕动物处死，剖
